Грунтовка для внешних работ: Грунтовка по дереву — характеристики и инструкция нанесения

Грунтовка по дереву — характеристики и инструкция нанесения

Дерево — экологически чистый и востребованный материал, используемый с целью производства не только мебели, но и другой продукции.

Грунтовка для обработки должна быть высокого качества и отличаться своей функциональностью. Благодаря этому можно исключить вероятности порчи поверхности изделия и обеспечить надежную защиту.

Введение в тему

Грунтовка по дереву — состав, поставляемый на рынок в жидком виде. Может быть использована для нанесения лака или будущую покраску.

Нередко производители включают в грунт для дерева специальные компоненты, которым характерно образование пленки, в частности:

• различные масла;
• битум;
• смолу;
• разные типы клея.

Дополнительно различные грунтовки для древесины содержат компоненты, предназначение которых заключается в быстром высыхании.

Состав и технические характеристики

Грунтовка по дереву под лак или покраску реализуется в жидком виде. Основная цель применения — обработка поверхности с целью проведения финишной отделки.

Основные компоненты состава:

1. масла;
2. смолы;
3. клей;
4. пигменты;
5. иные добавки и примеси.

Основные причины, по которым используется грунтовка глубокого проникновения по дереву, заключаются в защите от внешних факторов, в частности:

• от деформации и изменения в случае повышенной влажности;
• от выгорания деревянных поверхностей под воздействием ультрафиолетовых волн;
• от различных насекомых и грызунов, наносящих существенный урон древесине, разрушая при этом структуру.

По завершению обработки деревянных изделий материал обеззараживается, благодаря чему плесени и грибка можно не бояться. Благодаря дополнительной обработке грунтом, финишное покрытие по дереву для внутренних работ наносится равномерно, из-за чего достигается эффективная цепкость материала с поверхностью.

Грунт-антисептик для дерева для наружных работ и внешний позволяет наносить в несколько слоев, что обеспечивает максимальную защиту.

Расход на 1 м2

Вне зависимости от того, смесь используется для отделки помещений или внешних работ, расход зависит от состава.

Все без исключения производители указывают показатель на этикетки. Для защиты покрытия рекомендуется наносить грунт несколько раз.

Особенности

Грунтовка дерева перед покраской широко используется в качестве фундамента, на которое будет наноситься лакокрасочный материал.

Из особенностей выделяют:

1. грунт используется как для внешних по дереву работ, так и для наружных;
2. после проникновения в древесину, смесь полностью запечатывает поры, тем самым существенно укрепляет слои;
3. грунт формируется водоотталкивающую пленку, с помощью которой дерево обладает высокими эксплуатационными качествами даже под воздействием внешних факторов, к примеру, влажность воздуха уже не будет важна.

Особенности материала позволяют существенно сэкономить личных сбережений на дальнейших работах по отделке лакокрасочными смесями.

Правила грунтования деревянных поверхностей

Техника нанесения грунта для дерева не влечет за собой сложностей, как это может показаться на первый взгляд. Достаточно обработать поверхность с помощью кисточки либо валика.

Часто производители указывают на этикетках требуемую консистенцию и оптимальный инструмент в использовании.

В большинстве случаев строителями используется пульверизатор.

Классификация по составу

При выборе грунтовки глубокого проникновения, стоит помнить о ее различиях по составу. Благодаря этому можно подобрать для себя наиболее оптимальный тип.

На основе акрила

Акриловый грунт по дереву — универсальная смесь, с помощью которой можно надежно защитить поверхность от многочисленных внешних воздействий, обеспечив максимальную адгезию.

Акриловая грунтовка для дерева быстро впитывается и высыхает уже через несколько часов. Акрил не содержит резких запахов и отлично подходит для любой поверхности. Уникальные свойства и сильные стороны материала остаются незатронутыми.

На основе алкидных смол

Алкидная грунтовка по дереву повышает адгезию с обрабатываемого материала для успешного выполнения будущих работ.

Особенности:

• наличие отчетливого запаха;
• высыхание в течение 14 часов.

Является оптимальным вариантом в качестве применения для резного декора мебельной продукции.

Используется перед окрашиванием деревянной поверхности.

Силикон акриловые

Силиконовый грунт обладает следующими особенностями:

1. максимально защищает материал от воздействия влаги, в том числе и поддерживает на должном уровне внутренний баланс;
2. может использоваться совместно с сырой древесиной;

Помимо этого она формирует гидроизоляционный барьер.

Шеллаковые

По сути, считается вариацией грунтовочных смесей. Является оптимальным решением с целью обработки сырой древесины.

Оказывают существенную помощь в формировании изоляционных слоев материала после обрезания сучков и снятия коры.

Эпоксидные

Эпоксидная смесь и на основе полиуретана (полиуретановый грунт) — отделочная краска для дерева, в том числе и МДФ, разбавленная специально разработанным растворителем.

Их составы между собой различаются — все зависит от производителя.

Важно: специалисты не рекомендуют использовать смеси в обработке древесины. Оптимальным решением станет выбор другого грунта.

По функциональным особенностям

По своим функциональным особенностям смеси могут быть:

1. глубокого проникновения;
2. антикоррозийные;
3. антисептические и пр.

Рассмотрим каждый вид по отдельности.

Антикоррозийные и антисептические

В состав грунта входит антисептик для дерева. Антисептические свойства обеспечивают защиту от коррозии и насекомых.

Можно обрабатывать землю. Обработка почвы грунтовкой для денежного дерева состав которой содержит антисептик — отличное решение для защиты корневой системы.

Грунт антисептик Акватекс для дерева — пользуется популярностью среди строителей в России.

Грунтовка глубокого проникновения

Может использоваться на старую олифу с деревянных полов. Продолжительный период используется грунтовка по дереву марки Тиккурила.

Отличительной особенностью является наличие в составе масла льна. Смесь указанной марки позволяет обеспечить надежную защиту обрабатываемой поверхности от:

• воздействия влаги и сырости в частности;
• проявления плесени, грибка, гнили, из-за чего существенно снижается период эксплуатации.

Производитель Тиккурила представляет широкий выбор материалов для защиты древесины от многих факторов. Грунт не препятствует воздействию солнечных лучей, благодаря чему по завершению работ возникает необходимость покрыть лаком либо краской, причем сделать это нужно в максимально сжатые сроки.

Для обеспечения длительного срока эксплуатации, поверхность должна быть загрунтована специальным средством для мебели (если о ней идет речь).

Важно: грунтовка быстрого проникновения, вне зависимости от производителя, обеспечивает максимальный эффект в короткие сроки.

Грунтовка с лакировкой

Комбинирует грунт и лак. Является оптимальным решением для обработки деревянного поля и аналогичных поверхностей. Грунт для дерева позволяет не только надежно ее укрепить, но и существенно снизить затраты других не менее дорогих материалов.

Существенным преимуществом является возможность использования не только в отношении обычных полов, но и паркета в частности.

Средство с гидроизолирующими свойствами

Такой тип грунта является наиболее оптимальным. Связано с возможностью максимально эффективно защитить дерево от попадания в него влаги, чем увеличиваются эксплуатационные характеристики.

Универсальные

Универсальная грунтовка содержит в себе все вышеперечисленные компоненты. Особенность заключается в том, что в случае персонального сравнения с иными смесями, рассматриваемая грунтовка не может конкурировать с ними.

Основные критерии выбора

Для возможности верно подобрать грунт, необходимо ссылаться на некоторые параметры. Благодаря этому можно избежать ненужных дополнительных трат.

Место проведения работ

Прежде чем приобретать грунт для дерева важно знать, для внутренних или наружных работ она планируется использовать. Состав смеси может специально разрабатываться для улицы или же для помещения.

Важно: состав, предназначенный для внутренних работ нельзя использовать для покрытия дерева на улице.

Микроклимат

На отечественном рынке можно встретить грунт, который отличается повышенной устойчивостью к многочисленным внешним воздействиям, среди которых:

• сухой и горячий воздух;
• влажность;
• температурные колебания и пр.

В обязательном порядке требуется брать во внимание указанные свойства. Благодаря этому есть возможность применения грунта в местах с повышенной сыростью.

Время высыхания

Подобное значение необходимо учитывать при выборе грунта. В летний период года процедуру по обработке поверхности необходимо выполнять ранним утром или поздним вечером.

При работе на свежем воздухе период высыхания существенно сокращается. К примеру, алкидная смесь максимально быстро высыхает, при этом наносить нужно минимум 2 слоя.

Материал для последующей обработки

В зависимости от того, что именно планируется наносить на грунтованную поверхность, к примеру, лак или краску, нужно выбрать тип состава.

При желании есть возможность оставить естественный оттенок натурального дерева. Для этого настоятельно рекомендуется делать выбор в пользу прозрачных смесей совместно с лаками. Белая разновидность грунта позволяет раскрыть полноту и насыщенность краски.

Обзор популярных производителей

Наиболее популярными производителями, которые пользуются популярностью на отечественном рынке, являются:

1. Одиссей — Производитель делает акцент на изготовлении грунтовки глубокого проникновения. Может быть использована как для внутренних, так и наружных работ. Особенностью является отличное сочетание цены и качества.
2. Текс — Производитель занимается поставкой потребителю грунта-гидроизолятора. За годы работы компания смогла завоевать большую популярность у строителей.
3. Олимп — Компания специализируется на производстве бесцветных смесей для обработки древесины. Состав грунта позволяет говорить об увеличении эксплуатационных характеристик.
4. Тиккурила — Производитель уже долгие годы держит верхнюю строчку лидера по производству и продажам любых видов грунтовок. Эта компания не нуждается в дополнительной рекламе.
5. Оптимист — Среди населения пользуется популярностью алкидная грунтовка указанного производителя. Приобретая грунт Оптимист, можно удостовериться в отличном сочетании цены и качества.

Из рассмотренных производителей, наибольшие показатели популярностью уже долгие годы остаются за компанией Тиккурила. Состав реализуемого грунта позволяет надежно защитить дерево от многочисленных вредных воздействий и продлить его эксплуатационные параметры.

В любом случае перед выбором необходимо подсчитать требуемый объем грунта и отталкиваться от своих финансовых возможностей.

Грунтовка фасадная глубокого проникновения по штукатурке для наружных работ

Тщательная подготовка основания способствует увеличению срока службы для всего фасада. Качество материалов тоже сохраняется на долгое время. Грунтование относят к стадиям, требующим дополнительного внимания. Только при правильной эксплуатации грунтовка фасадная даст результат.

Грунт для фасадных работ под покраску – для чего нужен

Атмосферные осадки и другие факторы постепенно разрушают любые покрытия, которые эксплуатируются на свежем воздухе. Даже сайдинг и использование других современных материалов полностью от этого не защищает. Без предварительной обработки в таких условиях строительные материалы разрушаются слишком быстро.

Грунтовка для наружных работ фасадная способствует:

• Последующей отделке с уменьшенным расходом материалов;
• Повышенной влагоустойчивости. Влага не будет впитываться, даже при затяжных дождях;
• Увеличению прочности для основы. К примеру, штукатурки из цемента часто рушатся и осыпаются из-за рыхлой структуры. Достаточно применять грунтовки глубокого проникновения, чтобы избежать подобных негативных эффектов;
• Устойчивому финишному покрытию, равномерному распределению, надёжному сцеплению.

В составы могут добавлять и другие компоненты, улучшающие первоначальные свойства.

Без предварительной обработки в таких условиях строительные материалы разрушаются слишком быстро.

Как выбрать грунтовку для фасадов

Необходимо учитывать, какая разновидность постройки подвергается обработке. Тогда расход уменьшается, распределение по поверхности становится равномерным. Можно добиться и других результатов при принятии правильного решения, когда приобретается грунтовка для фасада.

Необходимо учитывать, какая разновидность постройки подвергается обработке.

Для деревянных фасадов

Антисептические свойства требуют в этом случае дополнительного внимания. Ведь требуется защитить исходный материал от появления вредных микроорганизмов. Это предотвратит появление плесени и грибковых заболеваний. Если правильно приобретать состав, силиконовый или другой – он справится со всеми задачами, которые встают перед владельцами деревянных фасадов.

Требуется защитить исходный материал от появления вредных микроорганизмов.

Для бетонных и кирпичных фасадов

Здесь штукатурка предполагает увеличение адгезии между материалами. На этом следует делать упор при покупке. Использование штукатурки короед даёт преимущество всем, кто заинтересован в решении следующих проблем:

• Повышение прочности;
• Обеспечение защиты;
• Украшение стен, составляющих внешний слой.

Этот материал позволяет создать поверхность, которая и правда словно проедена жуками из названия. Прочная разновидность составов, способная выдержать активную эксплуатацию при любых условиях. Декоративная отделка сверху в этом случае будет смотреться хорошо, составы подходят для любых наружных работ. Отлично укладывается поверх грунт-краски. Тогда бетон надёжно защищён.

Прочная разновидность составов, способная выдержать активную эксплуатацию при любых условиях.

Для металлических поверхностей

Защита против коррозии требует больше всего внимания. Оптимальное решение – одна из грунт-эмалей, к которой добавляют короед в качестве преобразователя ржавчины. Такой грунт фасадный позволит с минимальными потерями создать ровное покрытие, защищённое от негативных воздействий.

Защита против коррозии требует больше всего внимания.

Виды фасадных грунтовок и их свойства

У каждой разновидности – своё назначение. Поэтому с инструкцией рекомендуется ознакомиться до начала работы и даже до приобретения. В документах всегда описывают, с какими  тот или иной состав грунтовки для наружных работ сочетается лучше, когда даёт оптимальный результат.

Распространение получил состав таких разновидностей:

• Противокоррозионные;
• Микробицидные;
• Акриловые;
• Алкидные;
• Глубокого проникновения. Технический уровень прочности выше по сравнению с аналогам;
• Укрывающая;
• Обычная.

У каждой разновидности – своё назначение.

Состав грунтовочных смесей

При покупке грунтовок фасадных глубокого проникновения не обойтись без изучения упаковки с приведённой на ней информацией. Здесь содержится не только инструкция по применению, но и подробное описание технических характеристик. Это касается расхода, других подобных сведений.

Фасадные грунтовки разделяются на разновидности в том числе по составу:

• Двухкомпонентные полиуретановые. Считаются универсальными. Сочетаются с бетоном и штукатурками, другими поверхностями разных видов. Гарантируют высокие свойства по адгезии и укреплению имеющегося основания. Даже при нанесении на мокрые поверхности не уменьшают защитных свойств. Это важная характеристика;

  Гарантируют высокие свойства по адгезии и укреплению имеющегося основания.

• Алкидные, синтетического происхождения. Это эмали- и краски-грунты, которыми обрабатывают только металл или дерево. Для керамической плитки такая основа признаётся лучшей;

  Это эмали и краски-грунты, которыми обрабатывают только металл или дерево.

• Акриловые грунтовки для фасада по штукатурке, с соответствующими полимерами в качестве основы. Тоже считаются универсальными составами. Включают водно-дисперсионные группы и глубокого проникновения. Без токсичных веществ в составе, со способностью быстро сохнуть. Требуется разведение водой, чтобы добиться подходящей концентрации. Отличаются небольшим расходом на 1 квадратный метр. Особенно подходит, если основание – кирпич;

  Отличаются небольшим расходом на 1 квадратный метр.

• Минеральные. С составом, который включает гипс или цемент, известь. С густой консистенцией, которая способна сгладить любые неровности на стенах. Важно при подборе учитывать сочетание с теми или иными материалами. Кварцевый песок тоже этого требует.

  С густой консистенцией, которая способна сгладить любые неровности на стенах.

Как правильно грунтовать

Сначала рассчитывают расход, который определяется показателями впитываемости, степенью пористости основания и материалами под составом. Нормативы обычно приводятся на самой упаковке. Лучше учитывать и эксплуатационные условия. Иногда требуется не один слой, а сразу два или три для лучшего эффекта грунт краски фасадной.

Иногда требуется не один слой, а сразу два или три.

Ключевые этапы нанесения фасадной грунтовки

Главное – тщательно выровнять поверхность, избавиться от любых трещин и повреждений. При использовании концентрата обязательно разбавление с водой, при соблюдении указанных пропорций. При необходимости наносят несколько слоёв, универсальный состав не исключение.

Порядок работы имеет следующее описание:

1. Подготовка смеси для дальнейшего нанесения.
2. Обработка.
3. Просушка.
4. Выравнивание.
5. Окончательная зачистка. За ней уже следует покраска.

Каждая ситуация предполагает индивидуальный подход к выравниванию, причина – разные характеристики у материалов-оснований. Наждаки или железные щитки применяют в самых тяжёлых ситуациях. Инструкцию обязательно изучают перед разбавлением материала. Отдельно проверяют срок годности. Этого требует любой праймер.

При использовании концентрата обязательно разбавление с водой, при соблюдении указанных пропорций.

Согласно мнению профессиональных строителей, экономить на грунтовке и отделке фасада точно не стоит. Только при покупке качественного материала получится хороший результат, радующий долгие годы. Не придётся задумываться о повторной обработке поверхности.

Видео: Грунтование фасада грунт краской с кварцевым песком

для фасадных работ, глубокого проникновения, расход фасадного грунта

Во время отделки фасадов достаточно много внимания стоит уделять действительно качественной подготовке основания. Прежде, чем приступить к финишному покрытию, основу желательно дополнительно прогрунтовать. За счет этого получится защитить здания от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. В таких случаях потребуется использовать специальную грунтовку, которая предназначается именно для наружного типа работ.

Для чего грунтуют стены фасада

Грунтовка для наружных работ используется для того, чтобы можно было укрепить основание и при этом предоставить ему дополнительную защиту от влияния погодных условий.

Грунтовка для наружных работ используется для того, чтобы можно было укрепить основание и при этом предоставить ему дополнительную защиту от влияния погодных условий. Дополнительно грунтуют стены фасада для того, чтобы значительно увеличить срок эксплуатации здания и повысить качество сделанного ремонта.

За счет использования дополнительных составов во время строительных работ, отделочные материалы будут лучше ложиться на поверхность фасада, а само покрытие будет более прочным и долговечным. Грунтовки для наружных работ имеют некоторые особенности. К основным из них можно отнести следующее:

• Могут выполнять в некоторой степени изолирующую функцию.
• Не влияют на свойства внешнего основания и только улучшают их, делая более четко выраженными.
• Некоторые варианты современных грунтовок могут использоваться в самом конце работ по отделке фасада.

Не стоит забывать о том, что смеси такого типа имеют достаточно неплохой проникающий эффект. Грунтовка может проникать даже в небольшие поры, заполнять трещины или же пустоту, а также устранять разного рода дефекты. В состав продукции входят наполнители и разные типы пигментов, которые нужны для обеспечения изолирующей функции. Кроме того, удается добиться достаточно высокого показателя прочности фасада за счет дополнительной обработки поверхности грунтовкой.

Благодаря тому, что поры будут заполнены смесью, удается заметно снизить впитывающие свойства самого фасада. Это положительно сказывается на расходе отделочных материалов, а также дополнительно защищает здание от отрицательного воздействия влаги и осадков. Также подобным образом можно устранить незначительные дефекты, которые присутствуют на стенах и сделать основание более ровным и подходящим для дальнейшей обработки.

Виды грунтовок

В продаже можно найти несколько разных видов грунтовки, которая применяется исключительно для наружных работ.

Стоит учитывать то, какая именно поверхность будет обрабатываться и какими свойствами должен обладать используемый материал.

Для деревянных фасадов

Стены из натурального материала должны очень тщательно обрабатываться, особенно дерево, ведь оно отлично впитывает влагу, может начать гнить или же быть подверженным возникновению грибка, плесени. Для обработки подойдет алкидная грунтовка по дереву, в составе которой присутствуют не только качественные антисептики, но еще и специальные фунгицидные компоненты.

Для кирпичных и бетонных фасадов

Для того, чтобы увеличить срок эксплуатации фасада, а также сделать его внешне привлекательным, лучше использовать специальную пропитку короед для наружных работ. Шероховатая структура позволит добиться высокого показателя адгезии. Также преимуществом материала является то, что он отталкивает воду. Неплохим вариантом станут минеральные или же универсальные составы, основой которых является полиуретан.

Для металлических фасадов

Основной целью использования грунтовки для металлических конструкций – это не позволит в дальнейшем появляться коррозии и ржавчине. Именно поэтому для металлического фасада обязательно стоит использовать грунт-эмаль или же специальные преобразователи ржавчины. За счет применения подобной продукции, финишный слой лучше ложится на поверхность, а сама основа со временем не начнет терять свои характеристики.

Способы нанесения грунтовки на фасад

Для того, чтобы сделать состояние фасада лучше и повысить его характеристики, необходимо наносить грунт, учитывая некоторые этапы выполнения работы.

Если порядок действий будет нарушен, то срок эксплуатации того или иного объекта значительно уменьшится, а также будет хуже качество выполненных отделочных работ. Обязательно нужно учитывать правила обработки, чтобы получить действительно качественный результат.

• Сначала нужно подготовить основание к дальнейшей обработке. Для этого тщательно удаляется пыль, грязь, ржавчина, устраняются трещины большого размера и прочие дефекты, которые могут отрицательно повлиять на ремонтные работы.
• Дальше подготавливается к использованию грунтовка. Если была приобретена смесь готова к употреблению, то ее стоит тщательно перемешать. Если же состав нужно готовить самостоятельно, то он разводится в соответствии с инструкцией, указанной производителем.
• Грунтовка наносится на поверхность фасада сверху вниз. Для работы можно воспользоваться валиком, щеткой или краскопультом. В зависимости от того, какие именно характеристики имеет используемый грунт, наносить нужно будет от одного до трех слоев материала. Каждый слой обязательно должен хорошо просохнуть.
• Длительность высыхания грунтовки может отнимать до 24 часов. В том случае, если присутствует достаточно высокий показатель влажности воздуха, то срок высыхания может быть увеличен до нескольких дней.

Если на улице низкая температура, то желательно отказаться от грунтования фасада и подождать пока потеплеет хотя бы до 5 градусов. В противном случае, низкая температура может стать причиной потери важных свойств используемой смеси.

Расход

Расход смеси для грунтования будет зависеть от того, на какой именно материал он наносится, насколько пористая поверхность присутствует и как хорошо она будет впитывать состав. Соответственно, если показатель впитываемости достаточно высокий, то и грунтовки для обработки фасада нужно будет потратить намного больше.

На упаковках материалов можно найти примерные нормы расхода для каждого отдельного материала. Но если ремонтные работы выполняются в достаточно сложных условиях, то в таком случае грунта потребуется немного больше. Если на фасаде присутствуют неровности или же серьезные дефекты, то в таких местах потребуется нанесение нескольких слоев материала.

Фасадная грунтовка – это та продукция, которая должна обязательно использоваться во время наружных работ, чтобы улучшить общие характеристики, а также внешний вид здания и увеличить в несколько раз срок его эксплуатации.

Выбираем грунтовку для дерева под покраску для наружных работ

Грунтовки для наружного применения защищают древесину от воздействия влаги и солнечного света, обладают антисептическими и противогрибковыми свойствами.

Назначение препаратов данной категории общеизвестно. Применительно к древесине актуальность обработки грунтовкой приобретает еще большую значимость. Это объясняется просто – высокая пористость пиломатериала способствует интенсивному поглощению наносимых в дальнейшем лакокрасочных или клеевых составов. В результате – повышение их расхода и конечной стоимости оформительской работы. Разберемся с особенностями выбора грунтовки для древесины под покраску для наружных работ.

 Грунтовка для древесины под покраску 

• Краткая классификация грунтовок для дерева
• Виды грунтовок для дерева
  • Акриловые
  • Алкидные
  • Силиконово-акриловые
  • Шеллаковые
  • Составы полиуретановые и эпоксидные
  • Масляные грунтовки
  • Грунтовки антисептические
  • Олифа

• Грунтовки стирольные
• Несколько практических рекомендаций по выбору грунтовки

Лучшей грунтовкой считается та, которая по своим свойствам максимально соответствует задачам, решаемым мастером исходя из специфики ее применения. Это аксиома.

• Во-первых, ассортимент пропитывающих средств довольно большой, причем они отличаются не только ценой и производителем, но и некоторыми свойствами.
• Во-вторых, дерево также бывает самое разнообразное – лиственное или хвойное, с твердой или мягкой структурой.
• В-третьих, наружные работы – это общее понятие. На выбор лучшей грунтовки оказывают влияние и такие факторы, как климатические условия региона, удаленность строения от естественных водоемов, его расположение на местности (а это интенсивность воздействия ультрафиолета) и ряд других.

Чтобы сделать оптимальный выбор грунтовки, следует разбираться в основных характеристиках и особенностях применения пропиточных составов.

Краткая классификация грунтовок для дерева

Все составы категорируются следующим образом.

1. По назначению. С этим понятно, так как в данном случае рассматриваются грунтовки для наружных работ.
2. По проникновению в дерево – обычные или глубинные.
3. По направленности действия – антисептические, противогрибковые, водоотталкивающие, пожаробезопасные. По этому пункту стоит отметить, что практически все грунтовки в этом плане универсальны. В данном случае подразумевается, какие свойства состава более ярко выражены.
4. По оттенку – бесцветные или матовые (белые). В отдельную группу выделяются препараты для купажа. В таких грунтовках имеется красящее вещество, поэтому они выбираются индивидуально, под определенную текстуру дерева и тип лакокрасочного состава, которым планируется покрывать пиломатериал.
5. По основе – полиуретановые, алкидные, водяные, масляные, казеиновые.
6. По консистенции – пропитки и мастики.

Виды грунтовок для дерева

Разобравшись в особенностях тех или иных составов, значительно легче выбрать лучшее средство для наружных работ. Не зная местной специфики, рекомендовать что-то конкретное не решится ни один серьезный специалист.

Акриловые

Они растворяются водой, поэтому характеризуются хорошей текучестью. Следовательно, полным проникновением в дерево на большую глубину, без образования пленки на его поверхности. В основе таких грунтовок – смолы акриловые. Препараты данной группы считаются универсальными, так как на обработанную ими древесину одинаково хорошо ложатся все виды лаков и красок. Кроме того, они подходят как для внутренних, так и для наружных работ благодаря тому, что быстро просыхают и не имеют резкого запаха. Единственный минус – такие составы наносятся в несколько слоев, поэтому и расход соответствующий.

 Вывод – лучший выбор для наружных работ, если учесть, что цена не такая уж и большая (порядка 60 руб/л).

Алкидные

Защита дерева обеспечивается тончайшей пленкой, образующейся после просыхания грунтовки. Минус – для этого требуется не менее 10 – 12 часов. Для наружного применения – не самый лучший вариант, так как придется «подстраиваться» под погодные условия. Если учесть, что алкидные составы растворяются в воде, то в случае выпадения осадков пропитка, не успев окончательно схватиться, частично вымоется из пор дерева. Это значит, обработку придется повторить.

Вывод – грунтовки этой группы для наружного использования имеют ограничение в применении. Конкретно – по причине зависимости от погодных условий.

Силиконово-акриловые

Особенность грунтовок этой группы – в создании после просыхания качественной водоотталкивающей структуры, причем на всю глубину проникновения. После такой обработки заниматься дополнительно гидрофобизацией дерева не придется.  Вывод – целесообразно использовать в условиях, когда дерево подвергается избыточному воздействию влаги и подлежит покрытию непрозрачными составами. То есть в случае, если текстуру материала сохранять не требуется.  Остальные виды грунтующих составов отличаются спецификой применения в ходе наружных работ.

Шеллаковые

Этот тип грунтовок отлично подходит для обработки хвойной древесины. Препарат нивелирует последствие выделения смол, следовательно, предотвращает изменение фактуры дерева при повышении температуры окружающей среды. В некоторых случаях грунтовки шеллаковые применяются в качестве изолятора, если предполагается дальнейшая обработка пиломатериалов морилкой или красками на водной основе. Они предотвращают их глубинное проникновение, тем самым снижая расход.

Составы полиуретановые и эпоксидные

Подходят под любую краску и лак(все про обработку лаком читайте здесь), но отличаются несколько густой консистенцией. На поверхности образуется пленка, которая не позволяет дереву «дышать». С этими грунтовками следует обращаться осторожно, равно как и выбирать их, учитывая все «за» и «против». Они отличаются составами, текучестью, причем довольно сильно, поэтому нужно ориентироваться в первую очередь на рекомендации производителя.

Масляные грунтовки

Целесообразно обрабатывать ранее окрашенное дерево. Кроме того, если предполагается в дальнейшем использовать фасадную краску на масляной основе, то такие препараты – лучший выбор. 

Грунтовки антисептические

Об этой особенности состава можно узнать, ознакомившись с инструкцией. Такие препараты надежно защищают дерево от насекомых-древоточцев, плесени и грибка. Если местность характеризуется повышенной влажностью (например, при расположении дома в низменности, вблизи водоема), такие грунтовки – один из лучших вариантов.

Олифа

Она также относится к классу грунтующих составов. Надежно защищает дерево от гнили. Целесообразно использовать под масляные краски.

Грунтовки стирольные

Особенность в том, что после просыхания образуют непроникающий слой. Насколько это актуально для дерева, если учесть, что оно будет полностью изолировано, большой вопрос. Но то, что защита от погодных факторов обеспечивается максимальная – однозначно. Если предполагается окраска составами масляно-фталевыми, эмалями (в первую очередь, алкидными) – неплохой выбор.

Лучшая грунтовка для дерева не та, которая стоит дороже или продается под известным брендом. Главный критерий целесообразности приобретения препарата – соответствие его свойств специфике наружного применения.

Несколько практических рекомендаций по выбору грунтовки

1. Если требуется полностью сохранить структуру дерева, то нужно ориентироваться на грунтовки бесцветные.
2. Чем меньше пористость пиломатериала, тем большей текучестью должен характеризоваться пропитывающий состав.
3. Условия применения. По этому показателю грунтовки могут сильно отличаться. Поэтому такие характеристики, как допустимая температура воздуха, влажность в месте работ, следует уточнять сразу же.
4. Степень обработки дерева. Если требуется дополнительное выравнивание поверхности, то следует выбирать грунтовки алкидные. В этом плане они лучшие.
5. Время просыхания. Здесь комментарии излишни.

Все остальные критерии – «экологическая чистота» (токсичность), наличие/отсутствие запаха и ряд других для наружных работ вряд ли имеют значение.  опубликовано econet.ru  

Подписывайтесь на Эконет в Pinterest!

Если у вас возникли вопросы по этой теме, задайте их специалистам и читателям нашего проекта здесь.

P.S. И помните, всего лишь изменяя свое потребление — мы вместе изменяем мир! © econet

виды составов и правила грунтования

Профессиональные строители не станут проводить отделочные работы без предварительной подготовки. Грунтовка для стен под покраску, оклейку обоев, шпаклевку просто необходима. Некоторые заказчики, ознакомившись с предварительной сметой, пытаются оспаривать данную позицию. Профессионалы обязательно будут настаивать на проведении этих работ и объяснят их значение для качественного ремонта.

Какие функции выполняет грунтовка

Прежде чем приступать к процессу грунтования стен, нужно определиться с рядом факторов.

Основные из них:

• из каких материалов сделана стена;
• состояние покрытия;
• этапы ее отделки;
• какая будет финишная отделка.

Сразу следует отметить, что грунтовка для стен под покраску обязательна, даже если стена, на первый взгляд, без видимых изъянов. Если речь идет о вторичном ремонте, то требуется еще ряд подготовительных этапов подготовки.

Существует термин «адгезия» – способность материалов к сцепке между собой. Если краска ляжет неплотно, то со временем в определенных местах она начнет отслаиваться, даже если внешне после ремонта все выглядит идеально. Этому может способствовать перепады влажности и температуры, механическое воздействие, наличие сторонних веществ в глубоких слоях, к примеру, масляных пятен, и другие факторы.

Грунтовка перед покраской предотвратит отслаивание. Происходит сцепка благодаря полимерному составу смесей.

При определенных негативных условиях, в частности – плохой вентиляции помещений или неправильном утеплении стен, в них скапливается лишняя влага. Это провоцирует возникновению грибка. Одним из компонентов состава грунтующих смесей являются добавки (фунгициды), которые препятствуют этому процессу. Там, где существует повышенная угроза возникновения грибка, используется грунтовка под покраску глубокого проникновения с атисептическими свойствами.

Грунтовка стен перед покраской значительно уменьшает расход краски от 20 до 25 %.

Виды составов

Нужно определиться, какие составы используются для различных поверхностей, прежде чем грунтовать стены перед покраской.

К универсальным составам относятся акриловые грунтовки. Дополнительное их преимущество в том, что они достаточно быстро сохнут, в течение суток, и не имеют характерного запаха. Это наиболее часто используемые смеси.

Если вы в затруднении, какую грунтовку выбрать для стен, можете смело выбрать акриловую. Она подойдет под окраску бетонных, штукатуренных, гипсокартонных стен.

Для металлических и деревянных поверхностей существуют алкидные смеси. Грунты кладут после предварительной подготовки стен.

Для деревянных стен рекомендуют алюминиевые грунтовки. А вот поливинилацетатные используют для определенных видов красок, а также для деревянных, бетонных, отштукатуренных поверхностей.

Кирпич и определенные виды фактурной штукатурки обрабатывают силикатными составами.

Для наружных работ и пропитки конструкций из бетона используют эпоксидные составы. Это двухкомпонентные грунтовки. Их смешивают перед применением. Это очень стойкий вид грунта.

Подготовка поверхности

Грунтовка под покраску стен происходит в несколько этапов. Окрашиванию предшествует очистка от пыли и загрязнений. Для подготовки поверхности после уже существующего ремонта удаляют остатки старой краски, обоев. Заделывают шпаклевочными смесями щели, трещины, неровности. Предварительно эти места лучше тоже вскрыть грунтом.

После того как подсохнет шпаклевка, наносят грунтовку. Только после этого можно использовать краску. Выбранную грунтовку перед использованием тщательно вымешивают. Чаще всего для покрытия стен используют водоэмульсионные составы.

На видео: подготовка поверхностей к покраске.

Как наносится грунтовка под краску

Для нанесения грунта используют малярные кисти, валик и краскопульт. В большинстве случаев наносят с помощью валиков. В труднодоступных местах грунтуют малярными кистями. Краскопульт подходит для помещений с большой площадью.

Нанося грунтующие составы, используют в качестве защитных средств перчатки, очки, респиратор и головной убор.

Оптимальный температурный режим для нанесения грунта и его быстрого высыхания от + 5 до + 25 градусов. Расход материала грунтовки зависит от типа поверхности, вида грунтовки. Универсальные акриловые расходуются в среднем от 80 до 120 грамм на 1 м. кв.

Грунтовка стен под водоэмульсионку

Грунтовка под водоэмульсионную краску – важный этап перед нанесением финишного покрытия.

Самым безвредным видом лакокрасочных покрытий считается водоэмульсионная краска – безвредная, быстросохнущая. Она имеет самую широкую гамму цветов и оттенков. Готовится на основе белой краски путем добавления красящих пигментов.

В строительных супермаркетах есть специальное оборудование, с помощью которого смешиваются краски. Вам предлагают раскладку оттенков цветов под определенным номером и названием. Компьютер анализирует цвета и номера пигментов, которые должны дать данный оттенок. В дополнении к краске клиент покупает рекомендованный пигмент. В дозатор аппарата добавляют пигмент, он смешивается с краской. В результате получается цвет, который предварительно был выбран на раскладке.

Подготовка новых стен под покраску водоэмульсионной краской:

1. Отштукатуренную или гипсокартонную поверхность грунтуют.
2. Затем шпаклюют стартовым слоем, выравнивают поверхность при помощи абразивной сетки.
3. После того, как слой высохнет, наносят финишную шпаклевку. Следом шлифуют мелкозернистой сеткой.
4. Наносится слой грунта.
5. Когда грунтовка высохнет, стену покрывают водоэмульсионной краской в два слоя.

Для того чтобы покраска лежала идеально, и гарантировано не возникали трещины, дополнительно используют стеклохолст.

Грунтовка под покраску водоэмульсионной краской предварительно тщательно вымешивается для того, чтобы все компоненты равномерно распределились. Используют чаще всего универсальную акриловую грунтовку. Фасуется она в емкости различного объема от 1 до 10 литров.

Грунтовать старые стены перед покраской (для водоэмульсионной краски) рекомендуют дважды.

Наиболее известные производители грунтовок

Среди российских производителей выделяют компанию Бирсс. Пользуется спросом состав «Бетонконтакт» (универсальная). Она хорошо показала себя в качестве подготовительного слоя под покраску как для внутренних отделочных работ, так и для наружного использования.

Ceresit – это германский концерн. По его лицензии производят грунты во многих странах, в том числе – в России. Наиболее популярна марка СТ-17. Это универсальная грунтовка, в том числе – для покраски.

Еще одной популярной немецкой маркой является Knauf. В линейку наиболее известных составов входят:  КНАУФ-Кварцгрунд (универсальная грунтовочная смесь), КНАУФ-Изогрунд (глубокого проникновения), КНАУФ-Тифенгрунд (для внутренних отделочных работ).

Подводя итог, можно сделать вывод, что использование грунтовки в значительной мере повышает качественные характеристики отделочных работ. Она предохраняет поверхность от температурных перепадов, влажности, образования плесени и грибка. Её использование является гарантией того, что краска надежно и долго будет удерживаться на поверхности стен, поэтому опытные строители рекомендуют всегда выбирать грунтовку перед покраской.

В инструкциях по применению указывается, для каких поверхностей используется, в каких пропорциях. Дополнительную консультацию по поводу того, какую грунтовку выбрать, можно получить у специалистов строительных супермаркетов и на сайтах производителей.

Правила грунтовки поверхностей (2 видео)

Продукция разных производителей (33 фото)

Грунтовка для фасадных работ: виды, состав и нанесение

Чтобы внешняя отделка здания была качественной и имела длительный срок эксплуатации, необходимо правильно и тщательно подготовить основание. Без предварительной подготовки даже очень дорогостоящая штукатурка или покраска не будут служить долго. Одной из очень ответственных стадий подготовки является грунтование. Что такое грунтовка фасадная, как ее подбирать и какие функции она выполняет?

Для чего необходимо грунтовать фасад

Из-за того, что фасад здания находится снаружи, на открытом воздухе, он все время, 24 часа в сутки подвергается всевозможным пагубным воздействиям, вследствие которых отделочные материалы разрушаются. Это относится как к оштукатуренным, так и окрашенным стенам, а также тем, которые обшиты сайдингом, пластиком или металлическими панелями. Вследствие влияния влаги постепенно появляется плесень и грибки, возникает коррозия фасада, отделка медленно начинает отслаиваться и отваливаться. Это происходит из-за проникновения влаги, содержащейся в атмосферных осадках.

Для защиты поверхности фасада обязательно должна использоваться фасадная грунтовка, которая создает непроницаемый щит от проникновения влаги. Грунтующий состав, высыхая, образует очень тонкий и прочный слой, который превосходно отталкивает влагу. Поэтому даже когда на улице идут длительные, затяжные дожди, фасад дома остается абсолютно сухим.

Помимо того,  фасадная грунтовка дает 100% защиту от поглощения воды стенами фасада, она также необходима для того, чтобы:

•  значительно увеличивать сцепление стены с финишным покрытием, благодаря чему отделочные материалы равномерно ложатся и распределяются;
•  грунтовка глубокого проникновения делает существенно прочнее те основы, которые склонны осыпаться, этот вид грунта быстро проникает в самые глубокие поры и трещинки;
•  во время выполнения финишной отделки фасада в значительной мере уменьшается расход материалов, будь то краска, шпаклевка, или штукатурка;
•  защищать стены от развития грибков и плесени, а также от возгорания и появления ржавчины на металлических деталях, это становится возможным благодаря имеющимся в составе специальным добавкам.

Выбор грунтовки для фасадных работ

Чтобы грунтовка для фасадных работ была наиболее эффективной, ее необходимо правильно выбрать в магазине. В наше время изготовители производят всевозможные грунтовочные составы для наружных работ, применяемые под покраску, шпаклевку или штукатурку. К тому же, грунтовки для фасада различаются в зависимости от материала, на который они будут наноситься, на бетонное, кирпичное, деревянное, металлическое или другое основание.

1.  Кирпичные и бетонные стены являются прочными, они редко осыпаются, поэтому чаще всего их не нужно укреплять. Однако бетон и кирпич это довольно гладкие, плотные материалы, а это уменьшает адгезию. Поэтому если грунтовка для фасада будет наноситься на бетонную или кирпичную основу, то лучше выбирать гидрофобные смеси, обладающие достаточными адгезионными характеристиками.
2.  Металлические конструкции, к примеру, гаражи или батискафы тоже являются гладкими, к тому же на них появляется коррозия и ржавчина. Для их обработки нужно выбирать грунтовки, обладающие антикоррозионными свойствами, и имеющие в своем составе кварцевый песок, благодаря которому поверхность станет шероховатой, и финишные материалы будут гораздо лучше держаться.
3.  Если нужно обработать деревянные постройки, то стоит учитывать, что дерево может начать растрескивается, гнить, а также его поражают вредители и различные насекомые. К тому же деревянные здания подвержены возгоранию, поэтому их еще нужно обрабатывать составами, защищающими от огня. Выбирая для этих построек грунтовку, необходимо отдавать предпочтение смеси с антисептиками, инсектицидными добавками и антипиренами. Очень хорошо, если грунт будет содержать какую-либо смолу, которая надежно скрепляет волокна друг с другом, благодаря чему значительно уменьшатся впитывающие характеристики.
4.  Если постройка возведена из плит OSB, то для нее нужна другая грунтовочная смесь. Хотя древесную стружку пропитывают специальными смолами, защищающими от появления плесени и размножения насекомых, эти плиты все равно нужно обрабатывать грунтом, ведь на них очень плохо держится слой штукатурки, и покраска будет иметь длительный срок службы, если нанести грунтовочный состав. Для плит OSB желательно приобретать акриловую смесь, отличающуюся высоким показателем адгезии.
5.  Те дома, которые возведены из пеноблоков, ракушника и оштукатуренные, постепенно будут осыпаться, поэтому для них выбирают укрепляющее виды грунтовок, которые глубоко пропитывают материал, заполняют все мельчайшие трещины и поры, при этом склеивают все осыпающиеся частички.

В магазинах сегодня продают много универсальных грунтовок для наружных работ, которые подходят практически для любой поверхности. Однако прежде чем приобретать какой-либо состав, предварительно нужно ознакомиться с его техническими характеристиками и сферами применения, чтобы он точно подходил под конкретную ситуацию.

Разные составы грунтов

Грунтовки, которые можно приобрести сегодня, делятся на несколько типов:

•  акриловые грунтовки являются водорастворимыми, основанными на акриловых компонентах, обычно они универсальные, проникают глубоко в поверхность. Эти смеси не имеют токсичных веществ, высыхают достаточно быстро, расход этих грунтов для фасадных работ относительно небольшой. Используют их зачастую для внутренней отделки, однако могут применяться для нанесения на фасады зданий. Можно использовать для деревянных, бетонных поверхностей, а также плит OSB. Если в акриловой смеси содержатся силиконовые компоненты, то такие грунтовки отличаются повышенной гидрофобностью;
•  алкидные составы имеют антикоррозионные характеристики, обладают отличной адгезией и хорошо пропитывают различные материалы. При их нанесении на стенах фасада образуется крепкая пленка, которая отталкивает воду и влагу, является устойчивой к физическому воздействию и температурным скачкам. Алкидные составы могут наноситься на металлические, деревянные и бетонные здания, однако они не подходят для осыпающихся поверхностей. Эти смеси хорошо сочетаются с алкидными и акриловыми красками и плиточным клеем, поэтому их можно наносить под покраску или же под отделку кафелем;
•  минеральные составы изготавливаются из цемента, гипса или извести. Их часто используют, чтобы выравнивать стены. Эта грунтовка для наружных работ, наносимая по штукатурке, также ее можно наносить на бетон или кирпич. В составе нет токсичных компонентов, высыхая, она создает надежный водоотталкивающий слой;
•  полиуретановые грунтовки являются универсальными, у них очень высокий показатель адгезии. Эти смеси можно использовать для любого типа поверхности, их можно применять даже для влажных стен. Полиуретановые средства высыхают очень быстро, создают долговечную и эффективную защиту, после их нанесения поверхность можно покрасить или облицовывать любым материалом.

Правила нанесения грунтовки

Любой грунтовочный состав необходимо наносить на чистую поверхность наружной стены фасада. Перед использованием очистить стены от копоти, пыли, жирных и маслянистых пятен. Те участки, которые отслаиваются и крошатся, не стоит грунтовать, необходимо предварительно их тщательно очистить. Большинство видов грунтов не устраняют трещины и неровности, поэтому перед нанесением смеси нужно устранить все дефекты, например, шпаклевкой или штукатуркой, и только потом использовать грунт. Также желательно очистить стены от старого слоя краски или штукатурки, которые могут значительно уменьшить адгезию.

Те участки, которые заражены грибками и плесенью, зачистить при помощи металлической щетки, после чего обработать хлоркой. Жирные пятна удаляются каким-либо растворителем. С металлических деталей удаляется ржавчина, после чего они обезжириваются. В конце обязательно устраняется пыль.

Когда стены подготовлены, разводится грунтовочная смесь. Алкидные грунты зачастую изготавливаются уже готовыми к использованию, а акриловые разводятся обычной водопроводной водой. В инструкции обязательно будет указано, в какой пропорции, и при помощи какого растворителя нужно разбавлять смесь. Не допускается использование разбавленного состава для наружных работ на следующий день, а также нельзя смешивать разведенный грунт с концентрированным раствором.

Наносить грунтовку на поверхность можно валиком или широкой кисточкой. Смесь лучше налить в пластиковый лоток или поддон, тогда с ним гораздо удобнее работать. Нельзя допускать потеков и капель на стенах. Желательно грунтовать несколькими слоями, обязательно дожидаться, пока предыдущий слой полностью высохнет. Все инструменты после завершения работы необходимо тщательно вымыть проточной водой, брызги удалить при помощи уксуса или растворителя.

Инструмент для проектирования грунтовок

Введите номер доступа, gi или последовательность FASTA
(Предпочтительна запись refseq)
[?]
Очистить

Введите здесь шаблон PCR (несколько шаблонов в настоящее время не поддерживаются). Настоятельно рекомендуется по возможности использовать регистрацию refseq или GI (а не исходную последовательность ДНК), так как это позволяет Primer-BLAST лучше идентифицировать матрицу и, таким образом, лучше проверять специфичность праймера.
Шаблон не требуется, если ниже указаны как прямой, так и обратный праймеры.

Длина шаблона ограничена 50 000 бит / с. Если ваш шаблон длиннее, вам необходимо использовать диапазон праймеров для ограничения длины (т. Е. Установите поля прямого праймера «От» и обратного праймера «До», но оставьте поля прямого праймера «До» и обратного праймера «От» пустыми) .

Или загрузите файл FASTA

Спектр

[?]
Очистить

Из
Чтобы

Прямая грунтовка

Обратный праймер

Введите диапазоны позиций, если вы хотите, чтобы праймеры располагались на определенных сайтах. Позиции относятся к номерам оснований на плюсовой цепи вашего шаблона (т. Е. Позиция «От» всегда должна быть меньше, чем позиция «До» для данного праймера). Допускаются частичные диапазоны. Например, если вы хотите, чтобы продукт ПЦР располагался между положением 100 и положением 1000 на шаблоне, вы можете установить прямой праймер «От» на 100 и обратный праймер «До» на 1000 (но оставьте прямой праймер «К» и обратная грунтовка «От» пустой).

Обратите внимание, что диапазон положений прямого праймера может не перекрываться с диапазоном положений обратного праймера.

Инструмент для проектирования грунтовок

Введите номер доступа, gi или последовательность FASTA
(Предпочтительна запись refseq)
[?]
Очистить

Введите здесь шаблон PCR (несколько шаблонов в настоящее время не поддерживаются). Настоятельно рекомендуется по возможности использовать регистрацию refseq или GI (а не исходную последовательность ДНК), так как это позволяет Primer-BLAST лучше идентифицировать матрицу и, таким образом, лучше проверять специфичность праймера.

Шаблон не требуется, если ниже указаны как прямой, так и обратный праймеры.

Длина шаблона ограничена 50 000 бит / с. Если ваш шаблон длиннее, вам необходимо использовать диапазон праймеров для ограничения длины (т. Е. Установите поля прямого праймера «От» и обратного праймера «До», но оставьте поля прямого праймера «До» и обратного праймера «От» пустыми) .

Или загрузите файл FASTA

Спектр

[?]
Очистить

Из
Чтобы

Прямая грунтовка

Обратный праймер

Введите диапазоны позиций, если вы хотите, чтобы праймеры располагались на определенных сайтах. Позиции относятся к номерам оснований на плюсовой цепи вашего шаблона (т. Е. Позиция «От» всегда должна быть меньше, чем позиция «До» для данного праймера). Допускаются частичные диапазоны. Например, если вы хотите, чтобы продукт ПЦР располагался между положением 100 и положением 1000 на шаблоне, вы можете установить прямой праймер «От» на 100 и обратный праймер «До» на 1000 (но оставьте прямой праймер «К» и обратная грунтовка «От» пустой).

Обратите внимание, что диапазон положений прямого праймера может не перекрываться с диапазоном положений обратного праймера.

Frontiers | PolyMorphPredict: универсальный веб-инструмент для быстрого обнаружения полиморфных микросателлитных маркеров на основе данных полного генома и транскриптома

Введение

Хороший молекулярный маркер имеет такие атрибуты, как простота, изобилие / широкий охват генома, повсеместность, наследование / совместное доминирование и мультиаллелизм или полиморфизм среди геномов с универсальностью генотипирования с точки зрения воспроизводимости и возможности мультиплексирования при обнаружении (Powell et al. ., 1996). Микросателлит — это предполагаемые ДНК-маркеры последовательностей простых повторов последовательности (SSR), имеющих тандемные повторы (1–6 пар оснований). В данной популяции аллельные вариации генерируются из-за присущих термодинамическим свойствам повторяющейся последовательности, приводящей к внерегистровой репликации из-за события проскальзывания во время репликации (Victoria et al., 2011). Когда конкретный аллель имеет частоту> 1%, в популяции он называется полиморфным аллелем (Jarne and Lagoda, 1996). Поскольку локус SSR имеет более высокую частоту мутаций, это приводит к изменению длины аллельного массива (путем добавления или удаления повтора) и делает его предпочтительным гипервариабельным кодоминантным маркером.Его можно использовать в картировании сцепления, QTL и открытии генов, популяционной генетике, анализе родословной / отцовства, филогенетических и эволюционных исследованиях, регуляции генов и генетических нарушениях (Cavagnaro et al., 2010).

In vitro обнаружение микросателлитных маркеров является дорогостоящим, громоздким или трудоемким и требует много времени, поскольку оно включает создание небольшой вставочной геномной библиотеки, скрининг положительных клонов путем гибридизации, секвенирование и конструирование праймеров для анализа ПЦР, специфичного для одного локуса. Помимо этого, обнаружение полиморфизма in vitro и таких маркеров требует сквозного генотипирования, что также требует времени и затрат (Powell et al., 1996; Zhao et al., 2017). С появлением технологии секвенирования следующего поколения (NGS) время и стоимость идентификации таких микросателлитных повторов резко сократились, поэтому метод in silico заменил метод in vitro (Zhao et al., 2017). Микросателлитные повторы можно использовать в генотипировании / снятии отпечатков пальцев на основе ПЦР для более широкого применения (Zietkiewicz et al., 1994). Такая заявка также включает происхождение и идентификацию сорта (Testolin et al., 2000).

Предыдущий инструмент poly (Bizzaro and Marx, 2003), написанный на объектно-ориентированном языке сценариев Python, который дает вывод с указанием местоположения микроспутников, частот трактов и длины с помощью командной строки, что неудобно для пользователя. Анализ разнообразия трубопроводов (PDA) (Casillas and Barbadilla, 2004) может выполнять поиск полиморфизма в базе данных с оценкой генетического разнообразия без полиморфизма и праймеров для генотипирования. Инструмент анализа SSR (SAT) — это веб-приложение для поиска SSR и разработки праймеров, но оно имеет ограничение на загрузку последовательностей вручную, а также ограничение размера. Dereeper et al. (2007). Существует база данных полиморфных микросателлитов по конкретным видам, например, рис, имеющий только два сорта (Indica и Japonica), без возможности анализа других сортов риса или генотипирования с помощью электронной ПЦР (Zhang et al., 2007). QDD (Meglécz et al., 2010) — это программа с открытым доступом для открытия микросателлитов и конструирования праймеров, но она использует ограниченные файлы fasta размером <50 Кбайт.Хотя инструмент GMATo (Genome-wide Micros satellite Analyzing Tool) является мощным инструментом и может добывать микросателлит любого размера генома вместе с информацией о статистическом распределении микросателлита в геноме (Wang et al., 2013), он не может ни создавать праймеры, ни обнаруживать полиморфизм. Хотя pSTR Finder (Lee et al., 2015) может идентифицировать предполагаемые полиморфные STR-локусы, используя последовательность всего генома, и сравнивать два генома в формате fasta, но результат не имеет размера и положения аллеля, необходимых для генотипирования / мультиплексирования. CandiSSR (Xia et al., 2016) — это конвейер для выявления кандидатов полиморфных SSR на основе множества собранных последовательностей транскриптома / набора генома данного вида или рода, но имеет ограничение автономного режима, сложной системы на основе Linux / Unix, помимо зависимости других требований, таких как MISA, Primer3, ClustalW и проблемы времени выполнения. Конвейер PolySSR (Tang et al., 2008) и GMATo (Wang et al., 2013) имели ограничение автономного режима без предоставления обнаружения полиморфизма на основе внешнего праймера для использования и сравнения с более ранними аллельными данными.DnaSP (Розас и Розас, 1995), который основан на объединяющем методе полиморфного обнаружения, имеет большие ограничения, такие как автономность, входная последовательность ограничена числом <5 и размером <5 МБ. Полногеномный пакет инструментов для анализа микросателлитов (GMATA) объединяет микросателлитный анализ, статистический анализ, построение графиков, конструирование праймеров, скрининг полиморфизма и переносимость маркеров с помощью симулированного картирования маркеров / электронного картирования (Wang and Wang, 2016). Находясь в несерверном режиме, такой автономный инструмент не может использоваться биологическими исследователями, если у них нет специальных вычислительных навыков.Не существует вычислительного инструмента, в котором обнаружение микросателлитов генной области также может быть выполнено вместе с конструированием праймеров, а эффективность правильного конструирования может быть немедленно проверена с использованием того же инструмента путем проведения электронной ПЦР по всем данным генома, чтобы избежать интрон-содержащих ампликонов ПЦР.

Из-за различных ограничений в существующих инструментах, некоторые из них могут обнаружить микросателлит, но не могут вычислить праймеры или обнаружить полиморфизм, или имеют ограничение размера входной последовательности. Даже некоторые инструменты имеют интеграцию с различными существующими инструментами без автоматизации.Хотя доступно несколько мощных инструментов, они недоступны в удобном для пользователя режиме сервера. Ни один из более ранних инструментов не может удовлетворить потребность в обнаружении микросателлитного полиморфизма специфической целевой области хромосомы (например, области QTL) вместе с деталями местоположения и размером продукта, необходимыми для различных стратегий / мультиплексирования генотипа. Нет такого инструмента, который позволял бы использовать опубликованные праймеры в режиме электронной ПЦР для получения дополнительных данных и в то же время очень разумно использовать ранее сгенерированные данные.Наш разработанный инструмент преодолевает все эти ограничения, поэтому наш инструмент гораздо более прагматичен и осторожен в подходе.

Настоящая работа направлена ​​на разработку веб-инструмента, который может сравнивать различные полные геномные последовательности любых видов и их генотипов для обнаружения микросателлитных локусов и идентификации полиморфных локусов наряду с разработкой праймеров для быстрого генотипирования. Мы также стремимся разработать инструмент, позволяющий оценивать опубликованные праймеры для различных генотипов с in-видами и переносимость между гетерологичными видами в режиме электронной ПЦР для получения аллельных данных для управления и улучшения зародышевой плазмы, экологического разнообразия, популяционной генетики и эволюционного анализа.

Материалы и методы

PolyMorphPredict разработан для поиска микросателлитных локусов наряду с генерацией праймеров и обнаружением полиморфизма с использованием данных повторного секвенирования всего генома или обнаружения полиморфизма с помощью опубликованных праймеров данного генома / набора геномов / генотипов любого вида. Все модули работают вместе, независимо от используемых языков, например, Practical Extraction and Reporting Language, , то есть , Perl (64-разрядная версия, версия 5), R (версия 3.0) или Java (версия 7), и их можно вызывать по отдельности независимо.

PolyMorphPredict Стратегия разработки микроспутников и генерации праймеров

Этот модуль генерации праймеров объединяет MISA (Thiel et al., 2003) и Primer3core (Untergasser et al., 2012), где MISA добывает микросателлитные маркеры из целевых последовательностей (хромосомные данные / последовательность в формате fasta), предоставленные пользователем. Инструмент может извлекать фланкирующие последовательности размером 500 п.н. выше и 500 п.н. ниже целевых микросателлитных локусов из файла эталонного генома-мишени.Собственный сценарий PERL использовался для помощи в синтаксическом анализе вывода MISA для генерации праймеров с помощью интегрированного с ним Primer3core . Пользователь может изменить параметры MISA, такие как количество повторов и максимальное расстояние между двумя микроспутниками. Эти параметры могут позволить искать потенциально более высокие полиморфные локусы, чтобы снизить стоимость обнаружения полиморфизма в лаборатории. Поскольку этот инструмент разработан для быстрого обнаружения микросателлитного полиморфизма в проектах по повторному секвенированию генома, где матричный геном полностью секвенирован, параметры Primer3 по умолчанию использовались для получения единой Tm всех микросателлитных локусов для массового генотипирования.

Подход к обнаружению полиморфизма

Этот инструмент основан на алгоритме обнаружения полиморфизма длины аллелей путем вычисления разницы в размерах ампликонов в терминах пар оснований. Если нет различий в ампликоне е-ПЦР (размере продукта), значит, нет никакого полиморфизма между проанализированными генотипами. Этот модуль обнаружения полиморфизма имеет два субмодуля для выбора праймеров, а именно, саморазработанные праймеры (которые генерируют новые праймеры) и внешние праймеры (для использования уже опубликованных праймеров).Модуль Self-Designed Primers ищет входные файлы эталонного файла генома / хромосомы или конкретного вида, а также файлы генотипов, содержащие данные хромосом в формате fasta. Для удобства пользователей на веб-сервере встроены два генома эталонных моделей, а именно, рис и сахарная свекла, а также небольшой набор данных по соответствующим видам для обнаружения полиморфизма. Тем не менее, пользователь может загружать данные генома любого вида по хромосомам вместе с его повторно секвенированными данными для обнаружения полиморфизма. Пользователь может указать количество генотипов загруженных видов и выполнить поиск полиморфных маркеров с последующей загрузкой файлов генотипа / транскрипции.Будет отображен список полиморфных маркеров.

Для модуля «Внешние праймеры» пользователям предоставляется три варианта загрузки входных файлов (формат fasta), а именно: файл эталонного генома, файл хромосомы или файл конкретного вида. Для обнаружения полиморфных маркеров с использованием уже существующих праймеров на PERL были написаны сценарии для поиска локусов, имеющих праймеры во фланкирующей области генотипа, с использованием хромосомной матрицы данного генома любого вида. Продукты электронной ПЦР, имеющие разницу в размерах, вычисляются и выбираются для представления / отображения как полиморфные локусы.С помощью этого инструмента можно анализировать как геномные, так и транскриптомные микросателлиты. При разработке праймера, особенно с использованием транскриптомных данных, ожидаемого сбоя из-за соединения интрон-экзон можно избежать путем предварительной оценки с использованием этого инструмента с аннотированным эталонным геномом.

Предусмотрена возможность моделирования геля, разработанного с использованием кода R, для облегчения разработки недорогой стратегии генотипирования на основе геля. Полиморфные микросателлитные маркеры, обнаруженные в файлах эталонных и генотипических последовательностей, могут быть графически визуализированы на разработанном веб-сервере.Коды разрабатываются с использованием программного обеспечения R, которое может выводить на выходе размеры продукта для маркеров для одной и той же пары праймеров. Все файлы результатов можно либо загрузить напрямую, либо также получить по почте. JavaScript и HTML используются для разработки графического пользовательского интерфейса (GUI). Это внутренне вызывает PERL и R. Для микросателлитного поиска и генерации праймеров из этих маркеров требуется только входной файл (ы) генома / хромосомы (ов) в обычном / fasta формате. Это можно сделать щелчком мыши в графическом интерфейсе.Рабочий процесс показан на рисунке 1.

Рисунок 1. Схематическое изображение PolyMorphPredict для микросателлитного поиска, разработки праймеров и обнаружения полиморфизма.

Эффективность PolyMorphPredict для различного размера генома

Чтобы оценить эффективность in silico этого инструмента в царстве животных и растений, были отобраны модельные виды с геномами разного размера, представляющие три разных уровня сложности генома, а именно малый (<500 МБ), средний (500 МБ – 1 ГБ) и более крупный геном (> 2 ГБ), который также представлял животных и растения.Для риса и винограда с меньшим геномом ( Vitis ), сахарной свеклы с умеренным геномом ( Beta vulgaris ) и для крупного генома использовали крупный рогатый скот. Для обнаружения микросателлитного полиморфизма использовались геномные данные 21 различных генотипов / сортов, представляющих пять видов, а именно риса (6), сахарной свеклы (5), Vitis (5), Prunus (2) и крупного рогатого скота (3). Подробная информация о доступности этих геномных данных для всеобщего пользования представлена ​​в дополнительной таблице S1.

При оценке риса с меньшим геномом, имеющим размер генома 352 МБ, использовали 6 генотипов.В этом случае два сорта, а именно RP Bio-226 и Shuhui498, были использованы для разработки in silico микросателлита и обнаружения полиморфизма. Оставшиеся четыре разновидности генома риса (Cauvery, Dubraj, CO36 и CO39) были оценены для генотипирования на основе электронной ПЦР с известными высоконаблюдаемыми микросателлитными праймерами с последующей ПЦР in vitro для подтверждения открытия полиморфизма (Singh et al., 2013) . В случае другого меньшего генома, виноград (∼475 МБ), 5 сортов, а именно PN40024, Чхавери, Саперави, Месхетинский зеленый и Ркацители, были использованы для in silico добычи микросателлитов и обнаружения полиморфизма.Для умеренного генома использовали сахарную свеклу (∼750 МБ), 5 генотипов, а именно KWS2320, KWS230 Dh2440, STR06A6001, SynMono и SynTilling. Для оценки более крупного генома крупного рогатого скота (2670,14 МБ) использовались три фенотипически различных породы из разной географически изолированной популяции, а именно герефорд, неллор и гир. При анализе этого более крупного генома крупного рогатого скота использовалась самая большая хромосома 1 (158,3 МБ), где геном Херефорда использовался в качестве шаблона для открытия микросателлитного полиморфизма.

In silico Оценка переносимости микроспутников между видами

Для оценки этого модуля PolyMorphPredict были использованы данные из общественного достояния. Доступный геном черешни ( Prunus avium ) использовали в качестве основных видов, а персик ( Prunus persica ) использовали в качестве видов-хозяев. Было загружено всего 200 микросателлитных маркеров, имеющих простые динуклеотидные повторы из хромосомы 1 сборки генома вишни. е-ПЦР проводили с использованием последовательности полного генома Prunus в качестве матрицы.Истинные ампликоны микросателлитных локусов для электронной ПЦР были получены путем фильтрации ампликонов размером> 500 п.н. и асимметричного совпадения с последовательностью прямого или обратного праймера.

Валидация модели PolyMorphPredict для обнаружения полиморфизма: пример из риса

Чтобы оценить эффективность PolyMorphPredict для обнаружения полиморфизма, был проведен двухэтапный процесс, включающий in silico, ПЦР (е-ПЦР) с последующей in vitro, ПЦР с использованием четырех индийских сортов риса.

Обнаружение полиморфизма с помощью электронной ПЦР

Были отобраны четыре генотипа индийского риса, имеющие установленный статус сорта, также представляющие в пределах и между различными экологическими средами обитания, наряду с их доступностью в общественном достоянии проекта генома риса 3K IRRI, Филиппины (Li et al., 2014) для электронной ПЦР и наличие зародышевой плазмы для in vitro ПЦР. Для проверки была выбрана разнообразная экологическая панель зародышевой плазмы, выбранная одним представителем из экологических регионов центральной Индии, Дубрадж (Мадхья-Прадеш, 22.9734 ° N, 78,6569 ° E, агро- и субэкологическая зона), а еще один из южных экологических регионов Индии Кавери (Тамил Наду, 11,1271 ° N, 78,6569 ° E, агро- и субэкологическая зона) для оценки микросателлитного полиморфизма между экологическими регионами. . Для оценки полиморфизма в пределах одних и тех же географически перекрывающихся регионов (Тамил Наду) были взяты две дополнительные зародышевой плазмы, а именно CO36 и CO39 (Amaravathi). Данные о последовательности полного генома этих сортов риса были загружены для сборки и использованы. PolyMorphPredict вариант «оценка внешнего праймера» был использован для выполнения электронной ПЦР над этими геномами для получения полиморфных локусов.Результаты обнаружения полиморфизма с помощью in silico, ПЦР (e-PCR) и in vitro, ПЦР сравнивали с точки зрения полиморфизма длины аллеля.

Обнаружение полиморфизма с помощью in vitro ПЦР

Для выделения ДНК с помощью мини-набора для растений QIAGEN DNeasy (Hilden, Германия) семена каждого сорта риса (10–12 семян) были очищены от шелушения. Тонкий порошок получали путем измельчения ядер с помощью анализатора тканей (TissueLyser II Retsch, Германия) с набором адаптеров для анализатора тканей (QIAGEN).Для выделения ДНК соблюдали протокол мини-набора для растений QIAGEN DNeasy. Образцы ДНК проверяли на 0,8% геле и количественно определяли с помощью NanoDrop. Готовили разведения каждого образца ДНК до 10 нг / мкл и использовали для реакции ПЦР.

Для генотипирования сортов риса четыре микросателлитных маркера из четырех разных хромосом были выбраны из результатов электронной ПЦР для четырех различных сортов риса. Температуру амплификации для каждого праймера стандартизировали градиентной ПЦР с выбранными образцами риса.Общий объем реакционной смеси для ПЦР составлял 10 мкл и содержал 20 нг геномной ДНК, 2 мМ MgCl2, 1 × буфер, 0,2 нмоль каждого праймера, 0,2 мМ dNTP, 1 единицу ДНК-полимеразы Taq (Fermentas, Life Sciences, США. ). Условия для ПЦР-амплификации были следующими: начальная денатурация при 94 ° C в течение 4 минут, затем 36 циклов при 94 ° C в течение 30 секунд, Ta (59 ° C) в течение 45 секунд, 72 ° C в течение 1 минуты и окончательное удлинение при 72 ° C в течение 10 мин. ПЦР-ампликоны разделяли и визуализировали в автоматизированной системе гель-электрофореза QIAxcel (QIAGEN) с использованием реагентов, поставляемых с набором QIAxcel DNA High Resolution Kit.Метод OM800 QIAxcel использовался при напряжении ввода пробы 5 кВ, времени ввода пробы 10 с, напряжении разделения 3 кВ и времени разделения 800 с для лучшего разрешения ампликонов. Стандартные маркеры (QX Alignment Maker 15–500 п.н. и маркер размера ДНК QX 25–450 п.н.) использовали для определения размера ампликонов с помощью QIAxcel BioCalculator (версия 3.0.05).

Результаты и обсуждение

PolyMorphPredict Стратегия разработки микроспутников и генерации праймеров

PolyMorphPredict разработан для поиска микросателлитных локусов вместе с генерацией праймеров для обнаружения полиморфного локуса.Этот инструмент имеет шесть вкладок, а именно: «Главная», «Базовый дизайн», «Полиморфизм», «Алгоритм», «Учебник» и «Контакт». Домашняя страница состоит из краткого описания микросателлитного маркера, полиморфизма и обзора веб-сервера. Разработка праймеров — это первый основной модуль этого веб-сервера, где пользователь должен загрузить файл генома / данные по хромосомам / данные транскриптома (в формате fasta), из которых будут извлечены маркеры (с использованием MISA) и будут разработаны праймеры (с использованием Primer3 ) для этих маркеров.Выходной файл MISA служит входными данными для инструмента Primer3 . Primer3 генерирует пять наборов прямых и обратных праймеров для каждого добытого локуса. Для каждого набора он вычисляет соответствующий размер продукта и температуру плавления (Tm). После завершения работы пользователь может загрузить результаты по предоставленным гиперссылкам или указать идентификатор электронной почты для получения результатов.

Оценка открытия полиморфизма с использованием генома разного размера

PolyMorphPredict оказался успешным в обнаружении полиморфных локусов с тремя разными размерами генома.Результаты оценки геномов большего, среднего и меньшего размера доступны в дополнительных файлах S1 – S4. Поскольку для выявления полиморфизма в этих случаях мы выбрали простые динуклеотидные повторы, таким образом, мы получили значительное количество полиморфизма. Оценка проводилась с использованием простого повтора, который демонстрирует более высокую степень полиморфизма, чем составной повтор. Это связано с более высокой скоростью проскальзывания во время репликации ДНК (Ngai and Saitou, 2016). Эти анализы демонстрируют эффективность этого инструмента для разных размеров генома, а также для доменов животных и растений для обширного поиска микросателлитов по хромосомам.

Для этого второго основного модуля для обнаружения полиморфизма, подмодуля Self Design Primer, пользователь должен загрузить два типа входных файлов в формате .fasta , а именно , файл эталонной последовательности, который может быть файлом последовательности всего генома / хромосомным файлы / файлы для конкретных видов и файл генотипа. Пользователь также может выбрать видоспецифичную геномную последовательность, имеющую хромосомные данные в качестве эталонной последовательности. В настоящее время в веб-сервер встроены геномные последовательности двух культур, , а именно , риса ( Oryza sativa ) и сахарной свеклы ( Beta vulgaris ).Пользователь может выбрать хромосомные данные для культуры. Кроме того, пользователю предоставляется гибкость в выборе номера хромосом и их начального и конечного положения, откуда маркеры будут добываться для обнаружения полиморфизма. Список найденных полиморфных маркеров, если таковые имеются, будет отображен и может быть визуализирован графически, щелкнув «Просмотр геля». Результаты можно загрузить по указанному идентификатору электронной почты.

Аналогичным образом, для подмодуля «Внешние праймеры» пользователь может использовать праймеры, которые уже доступны в опубликованной литературе, и пользователь может проверить, способны ли они исследовать полиморфизм микросателлитных маркеров, присутствующий в генотипах, или нет.Пользователь должен предоставить «ввод» пар праймеров вместе с файлами эталонной последовательности и последовательности генотипа. В выходном файле результатов будут показаны детали полиморфных локусов, размеры продукта и вид геля для каждой пары праймеров, специфичных для микросателлитного локуса.

In silico Оценка переносимости микроспутников между видами

PolyMorphPredict был успешно использован для оценки переносимости микросателлитов с использованием модуля электронной ПЦР в гетерологичном режиме.Из 200 микросателлитов основных видов черешни ( Prunus avium ) 24 микросателлитных локуса были обнаружены в персике гетерологичного вида-хозяина ( Prunus persica ) (дополнительный файл S5). Переносимость этого гетерологичного способа зависит от генетической близости двух видов. Более высокая степень переносимости отражает генетическую близость в процессе дивергенции видов (Dirlewanger et al., 2002). Поскольку существует> 700 видов Prunus (Depypere et al., 2007) и последовательности генома всех не доступны, поэтому наш инструмент может быть еще более многообещающим для определения приоритетов микросателлитных локусов, которые не только присутствуют у разных видов, но и имеют более высокую степень полиморфизма.

Валидация модели PolyMorphPredict для обнаружения полиморфизма: пример из риса

Обнаружение полиморфизма с помощью электронной ПЦР

Результаты, полученные с помощью электронной ПЦР на четырех индийских сортах риса из 36 наиболее полиморфных маркеров серии HvSSR (высоко вариабельный SSR) (три маркера на хромосому), позволили успешно обнаружить только 12 локусов.Результат валидации влажной лаборатории успешно демонстрирует полиморфизм выбранных локусов. Из 36 локусов, которые были подвергнуты е-ПЦР, только 24 были с размером продукта ПЦР (дополнительная таблица S2). Оставшиеся 12 локусов не могут быть обнаружены с помощью электронной ПЦР, что может быть связано с отсутствием соответствующих последовательностей в данных повторной последовательности соответствующих разновидностей. Из 24 обнаруженных локусов десять оказались полиморфными, а остальные 14 были либо мономорфными, либо отсутствовали.

Обнаружение полиморфизма с помощью in vitro ПЦР

Среди десяти полиморфных локусов е-ПЦР мы выбрали четыре разных микросателлитных локуса из разных хромосом для проверки in vitro и ПЦР.Аллельные данные, полученные с помощью влажной лабораторной проверки всех четырех локусов, соответствовали аллельному профилю, полученному с помощью электронной ПЦР с помощью PolyMorphPredict . Сравнение in silico (e-PCR) и in vitro. Результаты генотипирования PCR представлены в таблице 1. Эти результаты влажной лаборатории подтверждают полезность этого инструмента для быстрого обнаружения полиморфизма, экономящего время, энергию и затраты (Рисунок 2).

Таблица 1. Сравнение генотипирования микросателлитных локусов риса с помощью in silico и in vitro ПЦР.

Рис. 2. Обнаружение полиморфизма с помощью автоматизированного гель-электрофореза QIAxcel на основе дифференциации микросателлитных аллелей.

Этот инструмент разработан для быстрого обнаружения микросателлитного полиморфизма в проектах повторного секвенирования генома, где доступен эталонный шаблон генома с геномными данными по хромосомам или транскриптомными данными в формате fasta. Поскольку это инструмент массового исследования микросателлитов, предназначенный для обнаружения полиморфных локусов, параметры MISA по умолчанию были использованы для получения локусов, имеющих более высокую вероятность предполагаемого полиморфного региона по всей хромосоме.Аналогичным образом, параметры по умолчанию для Primer3 использовались для получения однородной Tm всех микросателлитных локусов для массового генотипирования. Если обнаружение полиморфизма было выполнено с использованием транскриптомных данных, то созданный праймер можно оценить с помощью «внешнего праймера . ”Такая дополнительная оценка праймера с использованием шаблона эталонного генома пользователя может избежать сбоя in vitro ПЦР, который может произойти из-за соединения экзон-интрон в геномной ДНК. Поскольку инструмент дает четыре набора праймеров для каждого локуса, таким образом, вероятность появления мутировавшего 3′-концевого участка связывания праймера, приводящего к сбою ПЦР, может быть легко устранена с помощью оставшегося набора праймеров.Даже вероятность того, что мутировавший сайт связывания 3′-конца праймера, ведущий к неудаче ПЦР, может быть легко устранена с помощью оставшегося набора праймеров, поскольку инструмент дает четыре набора праймеров для каждого локуса.

Часто при конструировании праймеров требуется маневренность параметров строгости, что позволяет избежать несоответствия праймеров и настроить размер продукта ПЦР на более коротком фрагменте ДНК. Такие ситуации часто встречаются при использовании праймеров в режиме гетерологичных видов, когда ожидаются нулевые аллели. Поскольку все входные последовательности в массовом обнаружении микросателлитного полиморфизма являются результатом повторного секвенирования одного вида, таких ситуаций не ожидается.Более того, в геноме эукариот эти микросателлиты распространены наиболее широко, что устраняет необходимость в таких мерах предосторожности. Обнаружение полиморфизма у некоторых видов растений может столкнуться с проблемой паралогии, когда один набор праймеров имеет сайт связывания на нескольких хромосомах. Такое мультилокусное, мультихромосомное генотипирование будет генерировать ошибочные аллельные данные, демонстрируя множественные полосы при генотипировании на основе геля или множественные числа аллелей в автоматическом генотипе. Паралогия часто встречается у видов, имеющих полиплоидию или аллополиплоидию (Korbecka et al., 2010). Этот инструмент можно использовать для решения проблемы паралогии с помощью оценки «внешнего праймера» с индивидуальной хромосомой / набором субгеномов. Путем такой оценки локусы паралога могут быть отброшены перед влажной лабораторной валидацией, что экономит время и затраты на генотипирование.

Интересно, что этот единственный сервер можно использовать для анализа данных последовательностей как ДНК, так и РНК для обнаружения микросателлитного полиморфизма. Может быть обнаружен даже микросателлит генной области, основанный на транскриптоме, и могут быть разработаны праймеры для генотипирования.Такие праймеры генной области могут быть подтверждены электронным способом путем проведения электронной ПЦР в нашем инструменте с использованием эталонного генома. Таким образом, наш инструмент также может быть использован для оценки эффективности генотипирования генного микросателлита или конструирования предполагаемого праймера маркера функционального домена. Такой праймер генной области должен быть сконструирован таким образом, чтобы избежать интронных соединений в матрице ПЦР, чтобы генерировать точные аллельные данные по геномной ДНК различных генотипов. Такая первоначальная оценка может сэкономить затраты на синтез олигонуклеотидов и избежать сбоев / ошибочных результатов в лабораторной проверке микросателлитных праймеров генной области над геномной ДНК.Создатели полногеномных микросателлитов, разработанные и отображаемые в графическом виде на нашем сервере, с возможностью синтеза праймеров непосредственно для желаемых участков хромосомы, упростят разработку маркеров для быстрого генотипирования. PolyMorphPredict будет полезен для сокращения затрат и времени, а также для определения приоритетов микросателлитных локусов, необходимых для мультиплексирования при генотипировании. Такая быстрая идентификация полиморфных локусов вместе с готовыми к использованию праймерами для генотипирования может иметь огромное значение для экологического разнообразия, популяционной генетики и эволюции.Например, в случае исследований разнообразия они использовались для оценки функционального разнообразия (Acuña et al., 2012), оценки разнообразия экологических признаков (van Tienderen et al., 2002). Молекулярные маркеры использовались для вычисления важных атрибутов экологической популяции (Putman and Carbone, 2014), таких как оценка инбридинга (Al-Atiyat, 2016) и родства (Taylor, 2015), оценка жизнеспособности популяции и скорости вымирания (Sattler et al. ., 2017), генеалогические регистрации и решения по сохранению (Sereno et al., 2008). При разработке стратегий сохранения, основанных на правиле сохранения 50/500 Франклина (Franklin, 1980), такой инструмент можно использовать для оценки эффективного размера популяции и оптимального размера переписи, чтобы рационализировать и оптимизировать фактор времени и затрат при формулировании программы сохранения. Допустимый предел инбридинга (1% на поколение) в такой модели можно контролировать с помощью микросателлитных данных (Lehmkuhl, 1984). микросателлитные данные могут быть использованы при формулировании стратегии, необходимой для управления исчезающими видами (Jamieson et al., 2006) реинтродукция популяции (Jamieson, 2015) и разработка системы экологических моделей (Wheat, 2010).

Хотя этот инструмент был разработан в первую очередь для обнаружения полиморфизма только у модельных видов. В случае, если он используется для немодельных видов, он будет иметь ограничения, такие как недоступность хромосомных данных для упрощения вычислений. Известно, что такой подход немодельного использования имеет определенные ограничения, такие как скомпрометированный расчет разнообразия, нелинейная зависимость в оценке времени дивергенции с использованием генетического расстояния (Meglécz et al., 2012) и отбор микросателлитов с предвзятостью из-за избирательной консервативной ортологической области, ставящей под угрозу гомогенное представление локусов для генома в популяционной изменчивости (Li and Kimmel, 2013).

Помимо экологических и природоохранных приложений, PolyMorphPredict может использоваться для оценки, характеристики, идентификации, улучшения и управления зародышевой плазмой. Например, использование полиморфного микросателлита в тесте DUS для идентификации сортов и управления им (Yim et al., 2009), анализ разнообразия (Singh et al., 2013), отбор с помощью маркеров (MAS), отбор с помощью генов (GAS), локус количественных признаков (QTL) и картирование генов (Wu et al., 2015), улучшение зародышевой плазмы ( Леонова и др., 2011), прослеживаемость продукта / продукции (Fujita et al., 2009), отслеживание событий гибридизации и интрогрессии (Twyford and Ennos, 2012), дифференциация существенно производного сорта (EDV) / исходного сорта (IV) в случай спорных сортов (Kwon et al., 2005), чистоты семян и тестирования гибридов (Wang et al., 2014). PolyMorphPredict может также найти свое применение при идентификации и дифференциации грибов, тестировании происхождения у животных и рыб, признаках породы животных и рыб, завершении генома и т. Д.

Заключение

Разработан универсальный инструмент PolyMorphPredict , который добывает полиморфные микросателлитные локусы и вычисляет праймеры, используя как данные полногеномной ДНК, так и данные РНК транскриптома любого вида. В нем есть дополнительные возможности для проведения электронной ПЦР с использованием опубликованных или внешних праймеров для обнаружения полиморфизма внутри видов и переносимости между гетерологичными видами.Это может сократить время и затраты, необходимые для обнаружения полиморфизма микроспутников, без ущерба для точности и эффективности. Эффективность этого инструмента была оценена для исследования микросателлитного поиска, обнаружения полиморфизма и переносимости с использованием различных пяти видов, имеющих 21 генотип. Он ясно демонстрирует его огромное использование не только для ускорения исследований в области экологического разнообразия и эволюции, популяционно-генетического анализа, но также может иметь много практических преимуществ при управлении, улучшении и сохранении гермоплазмы.

Доступность пакета и требования

Модель PolyMorphPredict находится в свободном доступе для исследовательского сообщества для некоммерческого использования и доступна по адресу http://webtom.cabgrid.res.in/polypred/. Он работает в операционной системе Windows. Используемые языки: PERL, R, а также MISA и Primer3.

Стандарт отчетности

Данные, использованные в исследовании, взяты из общественного достояния, которое было упомянуто вместе с источником в рукописи.

Авторские взносы

DK, SJ и MI разработали тему исследования.VA, SJ, MI, UA, SF и RD выполнили вычислительный анализ и разработку сервера. RS провела проверку в лабораторных условиях. UA и SS разработали код для моделирования геля. RD, VA, SJ, MI и DK подготовили рукопись. DK, MI, SJ и AR редактировали рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантом CABin (номер гранта: F. No. Agril. Edn.4-1 / 2013-A & P) Индийского совета сельскохозяйственных исследований, Министерства сельского хозяйства и благосостояния фермеров, правительства Индии.Признана стипендия RD Индийского института сельскохозяйственных исследований в Нью-Дели.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарны Индийскому совету сельскохозяйственных исследований, Министерству сельского хозяйства и благосостояния фермеров, Правительству Индии за создание Advanced Super Computing Hub для Omics Knowledge in Agriculture (ASHOKA), где была проведена работа.Авторы также с благодарностью признают поддерживающую роль директоров ICAR-IASRI, ICAR-NBPGR и Исследовательского центра ICAR-CPCRI, Мохитнагар.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018.01966/full#supplementary-material

ТАБЛИЦА S1 | Список генотипов и их идентификационных кодов, используемых для обнаружения микросателлитного полиморфизма.

ТАБЛИЦА S2 | Список 36 локусов HvSSR, подвергнутых е-ПЦР.

ФАЙЛ S1 | Оценка обнаружения полиморфизма с помощью PolyMorphPredict с большим размером генома с использованием видов крупного рогатого скота.

ФАЙЛ S2 | Оценка обнаружения полиморфизма с помощью PolyMorphPredict с умеренным размером генома с использованием видов сахарной свеклы.

ФАЙЛ S3 | Оценка обнаружения полиморфизма с помощью PolyMorphPredict с меньшим размером генома с использованием видов риса.

ФАЙЛ S4 | Оценка обнаружения полиморфизма с помощью PolyMorphPredict с меньшим размером генома с использованием видов винограда.

ФАЙЛ S5 | Оценка возможности передачи микросателлитов между видами с помощью PolyMorphPredict с использованием рода Prunus.

Сокращения

ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота; DUS, своеобразие, однородность и стабильность; EDV, производная разновидность; ГАЗ — генетическая селекция; ИС, интеллектуальная собственность; IV — исходный сорт; MAS — отбор с помощью маркера; MISA, инструмент микроспутникового анализа; ПЦР, полимеразная цепная реакция; QTL, локус количественного признака; РНК, рибонуклеиновая кислота; SSR, простая последовательность повторений.

Сноски

1. http://cherry.kazusa.or.jp/#

Список литературы

Акуна, К. В., Вильяльба, П. В., Гарсия, М., Патхауэр, П., Хопп, Э., Маркучи, П. и др. (2012). Микросателлитные маркеры в генах-кандидатах на свойства древесины и их применение в оценке функционального разнообразия у Eucalyptus globulus . Электрон. J. Biotechnol. 15: 2.

Google Scholar

Аль-Атият Р. (2016). Микросателлитная оценка уровня инбридинга в популяциях овец небольшого эффективного размера. South Afr. J. Anim. Sci. 46, 54–62. DOI: 10.4314 / sajas.v46i1.7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кавагнаро, П. Ф., Сеналик, Д. А., Янг, Л., Саймон, П. В., Харкинс, Т. Т., Кодира, К. Д. и др. (2010). Полногеномная характеристика повторов простых последовательностей огурца ( Cucumis sativus L.). BMC Genomics 11: 569. DOI: 10.1186 / 1471-2164-11-569

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Депипере, Л., Chaerle, P., Mijnsbrugge, K.V, and Goetghebeur, P. (2007). Каменистый эндокарпий по размеру и изменчивости формы в prunus секции prunus. Ann. Бот. 100, 1585–1597. DOI: 10,1093 / aob / mcm260

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Dereeper, A., Argout, X., Billot, C., Rami, J. F., and Ruiz, M. (2007). SAT, гибкое и оптимизированное веб-приложение для разработки маркеров SSR. BMC Bioinformatics 8: 465. DOI: 10.1186 / 1471-2105-8-465

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дирлевангер, Э., Cosson, P., Tavaud, M., Aranzana, J., Poizat, C., Zanetto, A., et al. (2002). Разработка микросателлитных маркеров персика [ Prunus persica (L.) Batsch] и их использование в анализе генетического разнообразия персика и черешни ( Prunus avium L.). Теор. Appl. Genet. 105, 127–138. DOI: 10.1007 / s00122-002-0867-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Франклин И. Р. (1980). «Эволюционные изменения в малых популяциях», в Биология сохранения: эволюционно-экологическая перспектива , ред.Э. Суле и Б. А. Уилкокс (Сандерленд, Массачусетс: Sinauer), 135–150.

Google Scholar

Фудзита Ю., Фукуока Х. и Яно Х. (2009). Идентификация сортов пшеницы с использованием маркеров EST – SSR. Порода. Sci. 59, 159–167. DOI: 10.1270 / jsbbs.59.159

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джеймисон, И. Г. (2015). Значение популяционной генетики для управления небольшими естественными и повторно интродуцированными популяциями в Новой Зеландии. N. Z. J. Ecol. 39, 1–8.

Google Scholar

Джеймисон, И. Г., Уоллис, Г. П., и Бриски, Дж. В. (2006). Инбридинг и управление исчезающими видами: не идет ли Новая Зеландия в ногу с остальным миром? Консерв. Биол. 20, 38–47.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Корбека Г., Раймер П. Д., Харрис С. А. и Паннелл Дж. Р. (2010). Решение проблемы неоднозначной паралогии для маркерных локусов: микросателлитные маркеры с диплоидным наследованием у аллогексаплоида Mercurialis annua (Euphorbiaceae). J. Наследственность 101, 504–511. DOI: 10.1093 / jhered / esq026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Квон, Ю.С., Ли, Дж. М., Йи, Г. Б. и др. (2005). Использование SSR-маркеров в дополнение к тестам на отличительность, однородность и стабильность (DUS) сортов перца (Capsicum annuum L.). Молекулы и клетки . Берлин: Springer Science & Business Media BV, 19.

Google Scholar

Ли, Дж. К., Ценг, Б., Хо, Б.К., и Линакр, А. (2015). pSTR Finder: быстрый метод обнаружения полиморфных маркеров коротких тандемных повторов из полногеномных последовательностей. Расследование. Genet. 6:10. DOI: 10.1186 / s13323-015-0027-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лемкуль, Дж. Ф. (1984). Определение размера и дисперсии минимально жизнеспособных популяций для планирования землепользования и сохранения видов. Environ. Управляй. 8, 167–176. DOI: 10.1007 / BF01866938

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Леонова, И.Н., Будашкина, Е. Б., Калинина, Н. П., Рёдер, М. С., Бёрнер, А., Салина, Е. А. (2011). Triticum aestivum-Triticum timopheevii интрогрессивные линии как источник генов устойчивости к патогенам. Чех Дж. Генет. Порода растений. 47, S49 – S55. DOI: 10.17221 / 3254-CJGPB

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли Б. и Киммел М. (2013). Факторы, влияющие на систематическую ошибку установления размеров микросателлитных аллелей: влияние на оценки частоты мутаций. Генетика 195, 563–572.DOI: 10.1534 / genetics.113.154161

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли Дж. Й., Ван Дж. И Зейглер Р. С. (2014). Проект «3000 геномов риса»: новые возможности и задачи для будущих исследований риса. Gigascience 3: 8. DOI: 10.1186 / 2047-217X-3-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Meglécz, E., Costedoat, C., Dubut, V., et al. (2010). QDD: удобная программа для выбора микросателлитных маркеров и разработки праймеров из крупных проектов секвенирования. Биоинформатика 26, 403–404. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btp670

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Meglécz, E., Nève, G., Biffin, E., and Gardner, M.G. (2012). Разрушение филогенетического сигнала: обзор плотности микросателлитов в 454 последовательностях дробовика от 154 немодельных видов эукариот. PLoS One 7: e40861. DOI: 10.1371 / journal.pone.0040861

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нгаи, М.Й., Сайтоу Н. (2016). Влияние статуса совершенства на частоту мутаций микросателлитов у приматов. Антрополь. Sci. 124, 85–92. DOI: 10.1537 / ase.160124

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пауэлл, В., Махрей, Г. К., и Прован, Дж. (1996). Полиморфизм выявляется простыми повторами последовательности. Trends Plant Sci. 1, 215–222. DOI: 10.1016 / S1360-1385 (96) 86898-0

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Путман, А.И., и Карбоне, I. (2014). Проблемы анализа и интерпретации микросателлитных данных для популяционно-генетических исследований. Ecol. Evol. 4, 4399–4428. DOI: 10.1002 / ece3.1305

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Розас, Дж., И Розас, Р. (1995). DnaSP, полиморфизм последовательностей ДНК: интерактивная программа для оценки параметров популяционной генетики по данным последовательностей ДНК. Биоинформатика 11, 621–625. DOI: 10.1093 / биоинформатика / 11.6,621

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Саттлер, Р. Л., Уиллоуби, Дж. Р., и Суонсон, Б. Дж. (2017). Снижение гетерозиготности в большой, но изолированной популяции: 45-летнее исследование генетического разнообразия лосей на острове Рояль. PeerJ 5: e3584. DOI: 10.7717 / peerj.3584

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Серено, Ф. Т., Серено, Дж. Р., Вега-Пла, Дж. Л., и Дельгадо, Дж. В. (2008). Тестирование ДНК для проверки происхождения в ядре сохранения лошади Пантанейро. Genet. Мол. Биол. 31, 64–67. DOI: 10.1590 / S1415-47572008000100013

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Н., Чоудхури Д. Р., Сингх А. К., Кумар С., Шринивасан К., Тьяги Р. К. и др. (2013). Сравнение SSR и SNP-маркеров в оценке генетического разнообразия и популяционной структуры индийских сортов риса. PLoS One 8: e84136. DOI: 10.1371 / journal.pone.0084136

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тан, Дж., Болдуин, С. Дж., Джейкобс, Дж. М., Линден, К. Г., Фуррипс, Р. Э., Леуниссен, Дж. А. и др. (2008). Крупномасштабная идентификация полиморфных микросателлитов с использованием подхода in silico. BMC Bioinformatics 9: 374. DOI: 10.1186 / 1471-2105-9-374

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Testolin, R., Marrazzo, T., Cipriani, G., Quarta, R., Verde, I., Dettori, M. T., et al. (2000). Микросателлитная ДНК персика ( Prunus persica L. Batsch) и ее использование для снятия отпечатков пальцев и проверки генетического происхождения сортов. Геном 43, 512–520. DOI: 10.1139 / g00-010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тиль, Т., Михалек, В., Варшней, Р. К., и Гранер, А. (2003). Использование баз данных EST для разработки и характеристики генных SSR-маркеров ячменя ( Hordeum vulgare L.). Теор. Appl. Genet. 106, 411–422. DOI: 10.1007 / s00122-002-1031-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Унтергассер, А., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B.C., Remm, M., et al. (2012). Primer3 — новые возможности и интерфейсы. Nucleic Acids Res. 40: e115. DOI: 10.1093 / nar / gks596

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

van Tienderen, P.H., de Haan, A.A., van der Linden, C.G., and Vosman, B. (2002). Оценка биоразнообразия с использованием маркеров экологически важных признаков. Trends Ecol. Evol. 17, 577–582. DOI: 10.1016 / S0169-5347 (02) 02624-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, Л.X., Лю, Л. Х., Чжан, Ф. Т., Ли, Х., Панг, Б., и Чжао, К. (2014). Определение чистоты семян сортов пшеницы с использованием микросателлитных маркеров на основе исключения влияния негомозиготных локусов. Seed Sci. Technol. 42, 393–413. DOI: 10.15258 / sst.2014.42.3.07

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., Лу, П., и Луо, З. (2013). GMATo: новый инструмент для идентификации и анализа микросателлитов в больших геномах. Биоинформация 9, 541–544.DOI: 10.6026/97320630009541

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, X., и Ван, Л. (2016). GMATA: интегрированный программный пакет для анализа SSR в масштабе генома, разработки и просмотра маркеров. Фронт. Plant Sci. 7: 1350. DOI: 10.3389 / fpls.2016.01350

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wu, Q.H., Chen, Y.X., Zhou, S.H., Fu, L., Chen, J.J., Xiao, Y., et al. (2015). Построение высокоплотной карты генетического сцепления и QTL-картирование формы и размера зерна в популяции пшеницы Yanda1817 × Beinong6. PLoS One 10: e0118144. DOI: 10.1371 / journal.pone.0118144

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ся, Э. Х., Яо, К. Ю., Чжан, Х. Б., Цзян, Дж. Дж., Чжан, Л. П., и Гао, Л. З. (2016). CandiSSR: эффективный конвейер, используемый для идентификации возможных полиморфных SSR на основе нескольких собранных последовательностей. Фронт. Plant Sci. 6: 1171. DOI: 10.3389 / fpls.2015.01171

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йим, Г.Р., Дин, Д. Р., Ван, К. П., Леонг, В. Х., и Хонг, Ю. (2009). Микросателлитные маркеры для проверки отличимости, однородности и стабильности сортов Brassica chinensis (Xiao Baicai). Open Hortic. J. 2, 54–61. DOI: 10.2174 / 18748406000054

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, З., Дэн, Ю., Тан, Дж., Ху, С., Ю, Дж. И Сюэ, К. (2007). База данных по полногеномному микросателлитному полиморфизму для риса индика и японика. DNA Res. 14, 37–45. DOI: 10.1093 / dnares / dsm005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhao, C., Qiu, J., Agarwal, G., Wang, J., Ren, X., Xia, H., et al. (2017). Общегеномное открытие микросателлитных маркеров от диплоидных видов-предшественников, Arachis duranensis и A. ipaensis , и их применение в культивируемом арахисе ( A. hypogaea ). Фронт. Plant Sci. 8: 1209. DOI: 10.3389 / fpls.2017.01209

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зиткевич, Э., Рафальски, А., и Лабуда, Д. (1994). Фингерпринт генома путем амплификации полимеразной цепной реакции, закрепленной за простым повторением последовательности (SSR). Genomics 20, 176–183. DOI: 10.1006 / geno.1994.1151

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сайт-направленный мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции

\ n

2. Сайт-направленный мутагенез

\ n

Мутагенез обычно используется для понимания регуляторных областей генов и взаимосвязи между структурой белка и его функцией [1].В зависимости от количества сайтов, которые необходимо мутировать, сайт-направленный мутагенез можно разделить на два типа: простые или множественные мутации [2]. Для единичных мутаций методы основаны на амплификации двухцепочечной ДНК из плазмид с использованием комплементарных олигонуклеотидов, несущих интересующую мутацию [3]. Благодаря своей простоте, небольшому количеству затрачиваемых часов и высокой эффективности, это одна из наиболее распространенных стратегий введения мутаций во фрагменты ДНК. Для множественных мутаций методы включают желаемые мутации одновременно в одну и ту же реакцию или они получаются после нескольких циклов мутаций.

\ n

Существует ряд коммерческих наборов для простого мутагенеза. Эти наборы просты в использовании, но регулярно возникают проблемы с удалением больших файлов [4]. С целью преодоления ограничений коммерческого набора были разработаны другие методы для других приложений [5].

\ n \ n

2.1. Ферменты, используемые в сайт-направленном мутагенезе

\ n

Чтобы гарантировать точную амплификацию с помощью ПЦР, для сайт-мутагенеза обычно доступны версии высокоточных ДНК-полимераз.Общей чертой полимераз такого типа является их низкая частота ошибок. ДНК-полимеразы высокой точности содержат проверяющий домен, состоящий из полимеразной активности 5’-3 ’и экзонуклеазной активности 3’-5’, для удаления неправильно включенных нуклеотидов. В таблице 1 показаны наиболее типичные ферменты для амплификации ДНК с помощью ПЦР.

\ n

ДНК-полимеразы Pfu Turbo и KOD очень полезны для амплификации продуктов с комплементарными праймерами, однако ДНК-полимераза Phusion и другие не могут. Неудача, вероятно, связана с тем, что Phusion требует высоких температур отжига, и он способен способствовать образованию идеального соответствия комплементарных праймеров больше, чем образованию дуплекса праймер-матрица, содержащего несовпадения [6].

\ n

Другой важной частью сайт-направленного мутагенеза является устранение матрицы с помощью нуклеазы, распознающей метилирование, например, Dpn I. Хотя расщепление Dpn I может устранить полностью метилированную родительскую ДНК, около 20–30% гемиметилированные молекулы (родительская цепь в сочетании с цепью, генерируемой ПЦР) не могут быть удалены из-за гемиметилированной ДНК, и продукт ПЦР будет более устойчивым к Dpn I [7].

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

\ n

Таблица 1.

Опубликованные значения точности (частоты ошибок) для ДНК-полимераз.

Источник: Взято из McInerney et al. (2014) [8].

\ n \ n

2.1.1. Высококачественная ДНК-полимераза Phusion ^TM

\ n

Этот фермент производится New England Biolabs. Высококачественная ДНК-полимераза Phusion рекомендуется для амплификации ДНК с высокой точностью и надежностью.Эта ДНК-полимераза имеет уникальную структуру, полученную путем слияния дцДНК-связывающего домена с проверочной полимеразой, подобной Pyrococcus . Частота ошибок, указанная на веб-странице провайдера, в 50 раз ниже, чем у ДНК-полимеразы Taq , и в шесть раз ниже, чем у ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus [9]. Эта полимераза генерирует продукты с тупыми концами и может амплифицироваться из шаблонов, богатых GC.

\ n \ n \ n

2.1.2. Q5 ^® ДНК-полимераза высокого качества

\ n

Этот рекомбинантный фермент также производится New England Biolabs и описан как с точностью, так и с высокой производительностью.Согласно веб-странице провайдеров, ДНК-полимераза Q5 состоит из новой полимеразы, слитой с ДНК-связывающим доменом Sso7d. Его частота ошибок более чем в 100 раз ниже, чем у ДНК-полимеразы Taq и в 12 раз ниже, чем у ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus ( Pfu ) (рис. 1). Эта полимераза была оптимизирована с помощью буферной системы, чтобы обеспечить надежную амплификацию в областях, богатых GC. Более того, на веб-странице New England Biolabs есть калькулятор Tm для определения подходящей температуры отжига для праймеров в областях, богатых GC.

\ n

Рисунок 1.

Сравнение уровня верности среди ДНК-полимераз высокой верности. Изменено с: https://www.neb.com/products/pcr‐polymerases‐and‐amplification‐technologies/q5‐high‐fidelity‐dna‐polymerases/q5‐high‐fidelity‐dna‐polymerases.

\ n \ n \ n

2.1.3. AccuPrime ^TM Pfx

\ n

Этот продукт представляет собой препарат ДНК-полимеразы, полученный из штамма KOD Thermococcus видов [10, 11]. ThermoFisher Scientific отмечает, что эта полимераза является высокопроизводительной и обладает способностью к быстрому удлинению цепи.Препарат содержит антитело, связанное с неактивной полимеразой при температуре окружающей среды, но оно диссоциирует после начальной стадии денатурации при 94 ° C.

\ n \ n \ n

2.1.4. Pfu ДНК-полимераза сверхвысокого качества

\ n

ДНК-полимераза сверхвысокого качества Pfu (Agilent Technologies, Ла-Холла, Калифорния, США) представляет собой формулировку генно-инженерного мутанта ДНК-полимеразы Pfu и Фактор, усиливающий полимеразу ArchaeMaxx. По данным производителя, этот фермент демонстрирует средний уровень ошибок в три раза ниже, чем у Pfu Turbo ДНК-полимеразы и в 18 раз ниже, чем у ДНК-полимеразы Taq . Pfu Описана ДНК-полимераза сверхвысокой точности, которая обеспечивает надежную амплификацию длинных и сложных геномных мишеней. Фактор ArchaeMaxx устраняет dUTP, ингибитор ПЦР, и способствует более короткому времени продления, более высокому выходу и большей длине мишени. Фактически, фактор ArchaeMaxx действует как dUTPase.

\ n \ n \ n \ n

2.2. Эндонуклеаза Dpn I

\ n

Использование эндонуклеазы Dpn I, способной разрезать метилированную ДНК, позволило добиться прогресса в сайт-направленном мутагенезе.Плазмидная ДНК, выделенная из бактерий, содержит метилированную ДНК, что делает ее чувствительной к ферменту Dpn I [12], тогда как ДНК, амплифицированная с помощью ПЦР, не содержит метилированной ДНК. На основе этого принципа ПЦР с использованием плазмидной ДНК в качестве матрицы полезна для репликации и мутагенеза in vitro, и расщепления Dpn I. Продукты ПЦР, расщепленные Dpn I, широко используются в мутагенезе.

\ n \ n \ n

2.3. Сайт-направленный мутагенез в больших конструкциях

\ n

Наборы для мутагенеза QuikChange (Agilent Technologies) стали стандартом для разработки сайт-направленного мутагенеза благодаря простоте их протоколов и их высокой эффективности.Подход односайтового мутагенеза использует пару дополнительных мутагенных праймеров для амплификации целевой плазмиды [2]. Основная проблема при мутагенезе с большими вставками (до 2100 п.н.) связана с эффективностью, которая ниже, чем при малых и средних вставках. В этом случае одним ограничением для сайт-направленного мутагенеза является размер целевой плазмиды. Факторы, которые могут повлиять на эффективность метода, сосредоточены на качестве и эффективности используемых полимераз и праймеров [13].

\ n

Ван и др.[14] описали метод создания сайт-направленного мутагенеза в больших генах. Метод состоит из двух продуктов ПЦР с четырьмя праймерами (содержащими мутации и сайты рестрикционных ферментов). Фрагменты временно лигируют в векторы клонирования ТА, и после разрезания соответствующими ферментами фрагменты лигируют в конечный вектор (рис. 2).

\ n

Рисунок 2.

Схематическая диаграмма сайт-направленного мутагенеза в больших конструкциях. Два целевых генных сегмента амплифицируют из матричной ДНК с помощью ПЦР с использованием четырех праймеров, включая два фланкирующих праймера (а и d).Сайты рестрикционных ферментов (R1 и R4) включены. Представляющая интерес мутация (обозначена звездочкой) и / или мутация того же смысла вводятся для создания сайтов рестрикционных ферментов (R2 и R3). Затем фрагменты ПЦР ТА-субклонируются в Т-векторы, и один фрагмент вырезается (R1 и R2) и вставляется в Т-вектор (предварительно расщепленный R1 и R3), содержащий другой фрагмент.

\ n

Мунтяну и др. [13] использовали полимеразу KOD Hot Start в сочетании с праймерами, очищенными с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, для достижения сайт-направленного мутагенеза в большой плазмиде (до 16 т.п.н.).Процедура позволила включить одну или несколько базовых изменений, используя 6 циклов ПЦР вместо 18.

\ n \ n \ n

2.4. Сайт-направленный мутагенез, опосредованный вставкой сайтов рестрикции

\ n

Метод, описанный Rouached et al. [15] использует пластичность генетического кода и использование совместимых сайтов рестрикции (рис. 3). Метод разработан в два этапа. Сначала целевая ДНК субклонируется в векторе, который является матрицей для следующих двух ПЦР.Одна реакция амплифицируется от стартового кодона до мутагенизированного сайта, который содержит новый введенный сайт рестрикции. Другая реакция распространяется от мутагенизированного сайта, содержащего сайт рестрикции, до конца кодирующей последовательности. После амплификации продукты ПЦР расщепляют соответствующим ферментом и лигируют. Праймеры, содержащие сайт рестрикции, частично перекрываются, чтобы обеспечить сборку всей кодирующей последовательности в рамке считывания [15].

\ n

Рисунок 3.

Стратегия мутагенеза путем вставки сайта рестрикционного фермента.Панель А. Два продукта ПЦР получены из полноразмерной кодирующей последовательности. Мутации, включая сайт рестрикционного фермента, содержатся в праймерах b и c. Продукт ПЦР субклонируют отдельными клонируемыми векторами. Затем два фрагмента переваривают соответствующим ферментом и лигируют для повторной сборки с помощью кодирующей последовательности в рамке считывания. Панель B, пример аминокислотной замены после введения сайта рестрикции BglII.

\ n

Zhang et al. [16] сообщили о методе сайт-направленного мутагенеза, при котором они вводили сайты рестрикционных ферментов для облегчения скрининга мутантов (Рисунок 4).В этом методе в качестве матрицы используется плазмида дцДНК. Чтобы выбрать сайты рестрикционных ферментов для введения, авторы переводят последовательность ДНК в аминокислотную последовательность, а затем аминокислотную последовательность обратно транслируют в последовательность ДНК снова с вырожденными кодонами. Этот подход позволяет выбрать большое количество последовательностей с молчащими мутациями, которые содержат несколько сайтов рестрикционных ферментов. Трансформанты подвергают скринингу путем переваривания подходящим ферментом [16].

\ n

Рисунок 4.

Схематическая диаграмма сайт-направленного мутагенеза с введением сайта рестрикционного фермента. Праймеры содержат новый сайт рестрикционного фермента. После анализа ПЦР продукт фосфорилируется и лигируется для трансформации в штамм E. coli. После расщепления рестрикционным ферментом (XhoI) выбирают плазмиду для секвенирования. PNK, полинуклеотидкиназа; RE, эндонуклеаза рестрикции.

\ n \ n \ n

2.5. Высокопроизводительный сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, синтезированных на ДНК-чипах

\ n

. Чтобы создать серию конструкций с множественными мутантами, неограниченными по стоимости олигонуклеотидов, Saboulard et al.[17] описали первое поколение библиотеки одно- и множественных сайт-направленных мутантов с использованием смеси олигонуклеотидов, синтезированных на ДНК-чипах (рис. 5). В качестве модели они использовали ген человеческого интерлейкина15. Библиотека произвела 96 различных клонов в 37 различных кодонах с использованием пулов олигонуклеотидов. Авторы описали этот подход как простой и гибкий способ решения проблемы массового мутагенеза после последовательных раундов [17].

\ n

Рисунок 5.

Стратегия массового мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, синтезированных на ДНК-чипах.Олигонуклеотиды были синтезированы in situ путем микропроектирования на чипах. Эти олигонуклеотиды, элюированные в виде смеси, очищаются и фосфорилируются. Затем плазмида-мишень амплифицируется в одну цепь с мутагенными олигонуклеотидами. Амплифицированный продукт расщепляют с использованием DpnI, диализуют и трансформируют в E. coli. Может быть выполнено несколько последовательных туров. Анализ клонов производится путем секвенирования и / или ПЦР и рестрикционного анализа. Взято из Saboulard et al. [17].

\ n \ n \ n

2.6. Методы множественного сайт-направленного мутагенеза

\ n

Fushan et al. [18] разработали метод введения множественных и сложных мутаций в плазмиды без промежуточного субклонирования. Процедура изображена на фиг. 6. Последовательными раундами, каждый с амплификацией ПЦР с двумя неперекрывающимися парами праймеров, мутация вводится на 5 ’конце одного или обоих внутренних праймеров. Затем продукты ПЦР смешивают и лигируют для амплификации с внешними праймерами. Эти внешние праймеры являются адаптерами супрессии, чтобы ограничить амплификацию только целевой ДНК.Для создания других мутаций в качестве матрицы используется аликвота предыдущей реакции [18].

\ n

Рисунок 6.

Схематическое изображение сайт-направленного мутагенеза путем амплификации, лигирования и подавления ПЦР. Целевая ДНК амплифицируется с использованием двух пар праймеров (SO1, IR1, SO2 и IF1). Мутации находятся на 5 ’конце IR1. После амплификации фрагменты ДНК лигируют, образуя различные типы продуктов (правая панель). Затем ДНК амплифицируется с помощью подавляющих праймеров SO1 и SO2, где преобладающими продуктами являются молекулы типа C.После первого раунда мутагенеза аликвоту продукта используют в следующем раунде для введения новой мутации. После нескольких раундов конечный продукт расщепляют рестрикционными ферментами для субклонирования в векторе.

\ n

Другой метод создания множественного сайт-направленного мутагенеза разработан Holland et al. [19]. Они назвали свой метод мутагенезом AXM. Схема метода Холланда показана на рисунке 7. С помощью ПЦР с использованием полимеразы предрасположенности к ошибкам генерируется большой мутированный фрагмент ДНК с модифицированным праймером, содержащим фосфоротиоатную связь на 5’-конце.После амплификации обработка бактериофагом Т7-экзонуклеазой позволяет удалить цепь, синтезированную с немодифицированным праймером. Полученный продукт ПЦР представляет собой мегапраймер, который используют в последующей реакции мутагенеза. Путь эксцизионной репарации оснований ДНК в Escherichia coli способствует замене нуклеотидных оснований на ДНК, синтезируемую мегапримером, вместо комплементарной урацилированной последовательности ДНК [3, 19]. Этот метод способствует быстрой параллельной генерации нескольких мутагенных сайтов.Недавно был опубликован модифицированный метод этой процедуры, в котором фермент Eco29k I включен для избирательного разрушения исходной ДНК [3].

\ n

Рис. 7.

Схематическая процедура мутагенеза AXM. Проводится подверженная ошибкам реакция ПЦР (EP-PCR) с использованием обратного праймера, содержащего фосфоротиоатные связи на его 5 ’конце. Двухцепочечная ДНК обрабатывается экзонуклеазой Т7 для селективного разложения немодифицированной цепи молекулы дцДНК. Полученный мегапраймер затем отжигается с урацилированной кольцевой одноцепочечной фагмидной ДНК и используется для прайминга синтеза in vitro ДНК-полимеразой.Конечный продукт трансформируется в клетки E. coli AXE688, где урацилированная цепь удаляется урацил-N-гликозилазой, обеспечивая выживание вновь синтезированной рекомбинантной цепи, генерируемой мегапримером. Фермент Eco29k I выборочно разрушает исходную ДНК, сохраняя сайты узнавания Eco29k I.

\ n \ n \ n

2.7. Методы мультисайтового мутагенеза на основе рекомбинации

\ n

Trehan et al. [20] сообщили о методе, называемом REPLACR-мутагенез (рекомбинирование концов линеаризованных PLAsmids после ПЦР), который способен создавать мутации (замены, делеции и вставки) в плазмидах посредством рекомбинирования in vivo (рис. 8).REPLACR-мутагенез требует трансформации продуктов ПЦР в бактериях, экспрессирующих рекомбинантные белки Red / ET. В этом методе можно использовать самые разные плазмиды вплоть до бактериальных искусственных хромосом [20].

\ n

Рисунок 8.

Принцип REPLACR-мутагенеза и стратегия конструирования праймеров для замены, вставки или делеции последовательности. (A) Праймеры, содержащие желаемую мутацию, перекрываются для рекомбинации. Бактерии, экспрессирующие рекомбинантные белки (Redγ, β, α и RecA), трансформируют с помощью продукта ПЦР.Рекомбинация происходит внутри бактерий, и после извлечения плазмиды мутации подтверждаются ПЦР и секвенированием. (B) Пример прямого и обратного праймеров содержит желаемое добавление / замену. (C) Пример создания делеционных мутантов, где прямой праймер содержит последовательность, примыкающую к последовательности, подлежащей удалению, а обратный праймер содержит последовательность, гомологичную прямому праймеру и соседней последовательности в векторе.

\ n

Лян и др. [2] разработали метод одновременного введения до трех мутаций в плазмидную ДНК посредством гомологичной рекомбинации.Стратегия изображена на рисунке 9, и она совместима с множеством мутаций, включая вырожденные кодоны в плазмидах разного размера [2]. Процедура состоит из одного мультиплексного или трех независимых анализов ПЦР. Каждая пара праймеров содержит желаемую мутацию. Конечные продукты ПЦР имеют гомологию на конце и на конце для рекомбинации. После ПЦР проводится 15-минутный импульс рекомбинации, и образец трансформируется в E. coli .

\ n

Рисунок 9.

Стратегия мультисайтового мутагенеза путем гомологичной рекомбинации.Цифры обозначают сайты мутаций. Для введения трех мутированных сайтов обычно используются три пары перекрывающихся прямого и обратного праймеров, если только пара длинных праймеров не используется для покрытия сайтов мутаций, которые находятся в очень близкой близости.

\ n \ n \ n

2.8. Программные инструменты для создания праймеров сайт-направленного мутагенеза, вводящих «молчащие» сайты рестрикции

\ n

Критическими точками сайт-направленного мутагенеза являются дизайн праймера и температура отжига. Специальные программы, такие как Primer Generator и SiteFind [21, 22], можно использовать для конструирования сайта рестрикционного фермента в праймерах мутации без изменения транслируемой аминокислотной последовательности [12].

\ n

Например, SiteFind позволяет ввести сайт рестрикции рядом с точечной мутацией таким образом, чтобы сайт рестрикции не влиял на пептидную последовательность. Исходя из избыточности генетического кода, пептид может кодироваться разными последовательностями ДНК. Затем новый сайт рестрикции можно использовать в качестве маркера, который будет легко подвергаться скринингу [22]. Программа может работать с секвенциями до 400 п.н.

\ n

Другая разработанная программа — SDM-Assist, которая создает праймеры для сайт-направленного мутагенеза на основе их термодинамических характеристик.Праймер содержит желаемую мутацию и сайт рестрикции для идентификации мутантных конструкций. Алгоритм учитывает такие факторы, как Tm, содержание GC и вторичная структура [23].